快速鉴定辣椒抗根结线虫基因Me3的SCAR标记开发

发布时间：2020-06-15 00:37

【摘要】：根结线虫属于专性活体寄生病原物,每年危害5500多种作物,如辣椒和番茄等,会在世界范围内造成巨大的的经济损失。目前,防治根结线虫的措施大多以化学防治为主,生物防治为辅,对环境和人类健康危害较大,且增加生产成本。遵辣1号和CM334辣椒基因组的发表为辣椒基因分析提供了一种新工具。虽然在辣椒中找到了许多抗线虫基因,但是很少有抗线虫基因被精细定位及克隆。辣椒抗根结线虫Me3基因不仅能对南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫有广谱抗性,还能在高温条件下保持活性,因此,Me3基因可以作为一种优势的抗性基因资源被发掘。本实验结合基因组数据分析结果,利用SSR分子标记技术和Indel分子标记技术,在辣椒9号染色体上6 Mb大小的区间内开发了559个分子标记。首先在亲本和抗感池间筛选具有明显差异的分子标记,进而利用这些标记进行Me3基因的精细定位,确定Me3基因的候选区间。选取遗传距离与Me3基因最近的一个Indel分子标记转化成更加稳定的SCAR标记。在此基础上,以遵辣1号的基因组序列为参考,设计多对引物,分段扩增了Me3候选基因Capana09g000159基因的DNA序列和CDS序列。具体实验结果如下:1.利用SSR标记和Indel标记绘制精细定位图谱,筛选重组单株。通过筛选遵辣1号P9染色体上6 Mb大小区间内的SSR和Indel标记,确定7个与Me3基因连锁的精细定位标记,并用JoinMap 4.0软件绘制遗传图谱,结果显示,Me3基因位于Indel537标记和SSR381标记之间,且Indel537标记与Me3基因遗传距离最近,为0.5 cM。2.基于Indel537标记的测序结果,设计共显性分子标记SCAR537,用来鉴定待测辣椒植株是否具有根结线虫抗性。经PCR扩增后,实验结果可在琼脂糖凝胶电泳上检测,操作更加方便快捷。该标记在54株HDA149×茄门的F2代群体中的扩增结果和抗性鉴定结果完全一致,进一步说明该标记可用来鉴定待测辣椒植株是否根结线虫抗性。3.根据遵辣1号基因组序列,在抗病父本HDA149和感病母本8214中,克隆了Capana09g000159基因的DNA序列和cDNA序列。序列比对结果显示,抗病品种和感病品种之间确实存在多个SNP和插入缺失位点,这些突变导致了氨基酸序列的改变,并且与辣椒抗根结线虫特性相关。4.在前人的基础上,重新构建了Capana09g000163和Capana09g000164基因的TRV沉默载体,实验结果表明,Capana09g000163基因的沉默会对辣椒抗性有一定的影响,但是效果不明显。综上所述,本研究通过BSA法对辣椒抗感池进行了重测序,及F_2代大群体的表型鉴定,结合公布的遵辣1号基因组,设计得到了多个与Me3基因连锁的分子标记,并开发出一个与之紧密连锁的SCAR标记,不仅加速了分子标记辅助育种进程,也为Me3基因的精细定位及克隆打下了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.418.1
【图文】：

根结线虫,生活史

1.1.1 根结线虫的生物学特性根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种专性内寄生性线虫，寄主范围十分广泛，每年会危害多种作物，造成严重的经济损失（Jones et al., 2013）。根结线虫体型呈长管状，无脊椎，长小于 2 mm，属于线虫动物门（Nematoda），侧尾腺纲（Secernentea），垫刃目（Tylench异皮线虫科（Heteroderidae），根结亚科（Meloidogyninae），根结线虫属（Meloidogyne）。结线虫（M. incognita）寄主最广泛，可以侵染 1700 多种作物。此外，北方根结线虫（M. h花生根结线虫（M. arenaria），以及爪哇根结线虫（M. javanica）也是危害严重的主要线（Huang et al., 2016; Naz et al., 2013）。植物患上根结线虫病的典型特征是寄主植物根部有根结形成，根结中通常含有不同龄结线虫以及富含植物核酸、蛋白质的巨型细胞(Triantaphyllou and Hirschmann, 1960)。根结生活史与植物根结的结构密切相关（图 1.1）。根结线虫的卵通常粘附在根的表面，由胶状包裹，胚胎在卵内经历第一次蜕皮形成二龄幼虫（J2s），并用口针穿根部细胞壁，同时分素酶和果胶酶，从根尖伸长区侵入植物根部。刺激寄主细胞形成由 2-12 个巨型细胞组成的点，为线虫代谢提供营养，从而使得根部组织增生形成根结，严重危害根部的输导组织（PeMoens, 2006）。巨型细胞的存活依赖于线虫的不断刺激，当线虫死亡后，巨型细胞随之死

线虫抗性,鉴定结果,抗线虫,根结

图 2.1 HDA149（A）和遵辣 1 号（B）对南方线虫抗性鉴定结果Fig 2.1 The identification of HDA149 (A) and Zunla-1 (B) to M. incognita选 HDA149 和遵辣 1 号各 15 株长势相近的幼苗，每株接种 Me3 毒性性。结果显示：HDA149 的平均根结数为 35.0 个，平均卵块数为 42.数为 16.3 个，平均卵块数为 3.8 个（图 2.2）。遵辣 1 号的平均根结数9 有显著差异（P < 0.1）。由于 HDA149 中仅含 Me3 抗线虫基因，故其而毒性线虫虽然可侵染遵辣 1 号，但致病力明显小于 HDA149，故而能含有其它抗线虫基因（图 2.3）。图 2.2 HDA149 和遵辣 1 号对 Me3 毒性线虫抗性鉴定结果

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