棉花基因GhRac6的抗蚜功能研究

发布时间：2020-06-16 07:02

【摘要】：蚜虫是世界性的农作物害虫,其不仅刺吸植物汁液掠夺植物营养、分泌蜜露导致煤污病的发生,还可传播多种植物病毒病,对农作物造成严重危害。蚜虫不仅体型小,而且生活周期短、繁殖能力惊人,一年能繁殖20个世代左右,这些特点致使农药的频繁及不合理使用的情况加重,导致对多种农药具有抗性的高抗品种出现,从而使蚜虫的防治工作更加困难。因而,蚜虫的防治工作仍然任重而道远,寻求一种有效的、持久的和环保的防治蚜虫的方法一直是广大植保工作者的目标。而利用寄主植物本身对蚜虫的抗性防治蚜虫被认为是一种有效而且环境友好型的控制蚜虫方式,因而受到人们的普遍重视。但随着抗蚜基因的大范围持续使用,某些植物抗蚜基因对蚜虫失去抗性,这暗示着蚜虫的防治工作迟早面临更为严重的考验。因而,不断挖掘新的抗蚜基因,了解植物和蚜虫间相互作用的分子机理,充分利用作物抗蚜性,对于在持久的生产系统中实现对蚜虫的有效治理具有十分重要的意义。植物ROP/RAC蛋白属于Rho家族GTP酶的亚家族,它被认为是一种全能的分子开关,可调节各种植物发育过程,并对多种非生物胁和生物胁迫产生防御性反应。但是,它们是否具有抗虫性尚未报道。故我们在构建棉蚜诱导的鸡脚红叶棉叶片的抑制差减杂交cDNA文库的基础上克隆了1个ROP/RAC家族的一个新成员GhRac6,采用转基因技术对其在植物防御反应中功能及抗蚜机理进行了验证。结果如下:(1)以鸡脚红叶棉为材料克隆了棉花基因GhRac6(MG787184),GhRac6ORF的长度为636bp,编码211个氨基酸。其等电点为9.028,预测的蛋白质分子量为23,338.97 Da。(2)同源序列比对分析表明,GhRac6与其他植物物种的ROPs具有高度序列相似性(93.25%)。GhRac6和其他植物ROP蛋白的系统发育分析表明GhRac6与GhRac2的关系最密切,而与PeARAC8和cARAC8的关系较疏远。(3)经棉蚜取食诱导后,GhRac6的转录水平在棉花的叶和茎中被抑制,GhRac9的转录水平只在棉花的叶中被抑制,但蚜虫唾液诱导后,GhRac6和GhRac9的转录水平在棉花的叶中均显著上调。GhRac1和GhRac2的转录水平在蚜虫取食前期也被显著抑制,但蚜虫唾液诱导后无明显变化。(4)通过农杆菌介导法获得了GhRac6的转基因拟南芥植株。选取其中Line1,Line2和Line3三个株系进行抗虫性试验,无论是对桃蚜的选择性试验还是非选择性试验,转基因拟南芥上蚜虫的数量都少于野生型拟南芥上蚜虫的数量。对蚜虫蜜露分泌量的测定实验中,转基因拟南芥Line3上蚜虫的蜜露分泌量明显低于野生型拟南芥上蚜虫的蜜露分泌量,这些结果表明GhRac6的过量表达可以提高拟南芥对桃蚜的抗性。(5)为了阐述GhRac6提高拟南芥抗蚜性的机理,转基因拟南芥体内可溶性糖和脯氨酸含量,苯丙氨酸解氨酶活性,过氧化氢酶的活性以及叶片胼胝质的积累被检测。结果显示转基因拟南芥中可溶性糖含量和脯氨酸含量在一定程度上分别高于野生型;PAL和CAT在转基因拟南芥中的活性也高于野生型;转基因拟南芥中的胼胝质沉积比野生型更多。(6)GhRac6和GhRac9在棉花植株中的瞬时表达抗虫试验表明过量表达GhRac6和GhRac9的棉花叶片上蚜虫数量低于对照植物的蚜虫数量,且达到显著水平。(7)为了阐述GhRac6和GhRac9提高棉花抗蚜性的机理,检测了CAT、PPO、POD、PAL、NPR1、EDS1基因的转录水平,瞬时过表达GhRac6棉花叶片中POD、PPO、PAL和EDS1的转录水平显著上调,且POD和PAL达到极显著水平;瞬时过表达GhRac9棉花叶片中,CAT、POD、PPO和PAL的转录水平显著上调,且CAT、PPO和PAL达到极显著水平。
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.622.1
【图文】：

鸡脚红叶棉总RNA电泳图（M：DNAMarker2000，1:棉花总RNA）

棉花基因 GhRac6 的克隆及 pMD 18T-GhRac6 菌落检测（A）棉花基B）pMD 18T-GhRac6 菌落 PCR 检测（M：DNA Marker 2000, 1-3:目 Cloning of cotton gene GhRac6 and detection of pMD 18T GhRac6 bactne GhRac6（B）pMD 18T-GhRac6 bacteria PCR test (M: DNA Marker gene)Rac6 的测序结果与序列分析D 18-GhRac6 的阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技技术有限c6 ORF 的长度为 636 bp，编码 211 个氨基酸。其等电点为分子量为 23,338.97 Da（图 2-3）。同源序列比对分析表明，

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本文编号：2715710