柑橘溃疡病相关转录因子CsBZIP40的功能研究

发布时间：2020-06-16 08:29

【摘要】：柑橘溃疡病是一种由地毯黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)所引起的检疫性细菌病害,给世界柑橘产业造成巨大损失,目前还没有有效防治方法,培育抗病品种是解决柑橘溃疡病危害的根本途径。抗病基因资源发掘是抗病育种的基础,因此,本实验集合转录组数据分析和柑橘BZIP基因家族生物信息学分析,筛选到可能与柑橘抗溃疡病相关的候选基因CsBZIP40,并开展诱导表达分析、转基因功能验证,结果表明CsBZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个重要的转录因子,可为进一步抗病分子育种研究提供理论依据及抗病基因资源。本实验研究对象是在本课题组前期的转录组数据分析结合相关文献研究结果的基础上筛选到CsBZIP40。为确定CsBZIP40基因功能研究的可行性,首先利用柑橘全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据其染色体位置对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA6.0分析柑橘与拟南芥BZIP的系统发育关系,并且根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定CsBZIP40在拟南芥中同源基因的研究进展及功能。经过一系列的实验,我们从柑橘全基因组数据库中注释到47个BZIP转录因子,经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示CsBZIP40基因与拟南芥中AT1g08320同源基因,属于柑橘10个亚家族中参与病菌防御的D亚类,且AT1g08320与ROS介导的病原防御途径相关,为该基因功能研究提供理论支撑。随后,克隆CsBZIP40基因及其启动子,并进行基因序列和启动子元件分析。分析结果表明该基因序列全长5756 bp,开放阅读框长度为1530 bp,一共编码氨基酸509个,启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等。CsBZIP40含有核定位信号,通过构建GFP融合表达载体,并利用洋葱表皮亚细胞定位分析;实验证明此蛋白在细胞核内优势表达,具备转录因子发挥作用的前提。为了确定CsBZIP40的诱导表达模式,利用qRT-PCR方法分析感染溃疡病菌(Xcc)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(Wounding)对该转录因子的诱导表达。柑橘溃疡病菌侵染诱导表达结果表明,抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应,表明溃疡病菌诱导后,在纽荷尔脐橙和四季橘中CsBZIP40的表达存在差异性。本实验经研究发现外源水杨酸(SA)可使抗病品种四季橘CsBZIP40的表达水平显著上调,感病品种纽荷尔脐橙中CsBZIP40的表达水平先升后降;在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后感病纽荷尔中CsBZIP40有明显上调差异表达,抗病品种四季橘中CsBZIP40的表达水平下降,表明CsBZIP40可能是通过SA调控途径影响柑橘的品种抗性。为进一步确定CsBZIP40对柑橘溃疡病的影响,从而分析此转录因子与柑橘溃疡病抗、感的关系。通过构建CsBZIP40的超表达载体和干扰表达载体,并利用农杆菌介导法转化柑橘,我们共获得5株超表达CsBZIP40和11株干扰抑制表达CsBZIP40的转基因植株。利用离体接种溃疡病菌法,对转基因植株叶片进行抗性评价,超表达CsBZIP40的转基因植株可以明显降低柑橘溃疡病的病斑面积和病情指数,而干扰抑制表达CsBZIP40的转基因植株可以显著增加柑橘溃疡病斑的面积及病情指数。实验结果表明CsBZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个重要的转录因子,可能通过SA调节途径影响柑橘抗性,CsBZIP40的表达水平与柑橘溃疡病的抗性呈正相关关系,可以作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个重要候选基因,具有较大的应用价值。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66
【图文】：

橙汁,需求量,产量,柑橘

图 1. 橙汁产量与需求量的变化。Fig 1. The production of Citrus sinensis in resent years.注：数据来源：美国农业部。Note: data source: United States Department of Agriculture (USDA)..1.3 柑橘营养价值及市场需求对柑橘果实而言，水是基本成分，其果肉含水量为 85 % - 90 %，有机物约 15 %。有主要是蛋白质、氨基酸、多糖类、类黄酮、类胡萝卜素柠檬碱等小分子化合物。就不同、品种来说，种间差异较大[11]。近年来，柑橘因其本身的食用和药用价值及衍生出来的使用价值而饱受追捧。目前，已从柑橘中分离出 30 余种对人体起保健作用的成分，主要有：类黄酮、类胡萝卜素、素、类丙醇、甘油糖脂质等。柑橘中的香豆素是已被充分肯定的抗癌物质柠檬苦素对肿形成与发展具有抑制作用；维生素 C 是强氧化剂，可以使机体免于自由基的威胁。此皮、橘络、橘根、橘叶可以作为中药材入药，具通络、止痛、健脾等功效[12]。

基因结构,转录因子

OsTGA10 突变株可引起雄蕊不育，但在雄蕊发育过程中优势表达，而且该基因也是绒形成所必需的基因，由此可见某些 E 类亚家族成员在植物器官发育过程中也发挥作用[95然，BZIP 转录因子在与植株病害及其他信号途径方面也有相关研究，例如，番茄中eBZIP3 和 MeBZIP 受病原菌识别因子 flg22、 SA 信号途径及过氧化剂 H2O2 的调控表达 MeBZIP3 和 MeBZIP5 的转基因植株可以提高番茄对萎疫病（细菌性病害）的抗性由 VIGS 沉默表达系统介导的转基因植株更易感病；而番茄中的 SIBZIP 可以负调控 A号途径，对干旱和盐胁迫引起的防卫反应有抑制作用[96]。拟南芥中的 TGA9 和 TGA10与 ROXY1、 ROXY2 发生互作，在拟南芥开花和其他生理发育此过程中发挥作用，另除 TGA10 的突变株对 flg22 敏感，敲除 TGA9 的突变株对 flg22 不敏感，而 TGA9GA10 双敲除的突变体对 flg22 更敏感，另外， flg22 可以诱导这两个转录因子在叶片中达，参与叶绿体基质和类囊体中抗坏血酸过氧化物酶引起的防卫反应[97]。总体来看，植ZIP 转录因子在病害方面的研究应集中在 D 类 BZIP 成员，但该亚家族在柑橘溃疡病方作用还鲜有研究，因此，本实验以柑橘为材料针对 BZIP 转录因子进行基因功能研究，步探索 CsBZIP40 对柑橘溃疡病的影响，分析其在柑橘抗病育种中的价值，具有一定的意义。

【参考文献】