TCTP与溴氰菊酯耐受关系研究

发布时间：2020-06-16 10:49

【摘要】：翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种序列上高度保守的蛋白,广泛存在于动物、植物以及真菌体内,具有多种生物功能,包括调节细胞周期的进程和恶性转移、钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡等。黑腹果蝇(Drosophila rrelangaster)因其清晰的遗传背景以及便捷的实验操作,被广泛应用于生物化学、分子生物学和发育生物学等研究领域,是遗传学研究的重要模式生物。我们实验室前期实验发现,小菜蛾的溴氰菊酯抗性品系中TCTP的表达水平与敏感品系相比明显提高,但是TCTP是否与溴氰菊酯抗性相关,目前还没有文献报道。本研究对TCTP在溴氰菊酯、对硫磷和西维因应激中的作用及其与溴氰菊酯耐受的关系进行了初步探索,主要结果如下:1)用不同浓度的溴氰菊酯、对硫磷和西维因分别处理果蝇细胞48 h,RT-PCR测定果蝇Kc细胞中TCTP的表达水平。结果表明:在不同种类杀虫剂的处理下,细胞内TCTP基因的表达水平均有升高,其中溴氰菊酯的影响最明显。接着选取适宜浓度的溴氰菊酯,分别将果蝇细胞处理0h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,结果发现,在处理24 h时TCTP的表达量最高。2)为了进一步验证TCTP在溴氰菊酯应激下对细胞的保护作用,我们克隆TCTP基因的全长并转染进果蝇细胞,使用RT-PCR技术和Western blot来检测其转染率,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明:成功过表达的果蝇细胞与对照组细胞相比细胞的凋亡率明显下降,即对溴氰菊酯的抗性有明显的提高;而用dsRNA敲低TCTP在果蝇细胞中的表达,细胞的凋亡率显著上升,说明对溴氰菊酯的抗性明显下降。3)将溴氰菊酯抗性和敏感性品系小菜蛾幼虫分别提取RNA,并解剖头、中肠、脂肪体和肌肉四种组织提RNA,用RT-PCR检测TCTP基因的表达量,结果显示抗性品系整体TCTP表达量高于敏感品系,且头和脂肪体的TCTP基因表达量明显高于敏感性品系,抗性品系中TCTP呈现组成型高水平表达。上述结果表明:TCTP基因表达水平与昆虫对杀虫剂耐受之间存在一定的联系。TCTP基因的高表达能增强果蝇Kc细胞对溴氰菊酯的抗性能力,抗溴氰菊酯品系小菜蛾细胞中TCTP组成型高表达。因此,我们推论TCTP基因可能是与溴氰菊酯抗药性相关的候选基因,但是关于TCTP在溴氰菊酯抗药性中的作用机理仍需要深入的探究。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433
【图文】：

溴氰菊酯,细胞的,浓度

将ＲＮＡ用一步法反转录成ｃＤＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ实验。实验结果表明，处理不同逡逑时间的细胞的ｒｃｒｐ的表达量具有明显的差异，并且和对照组相比ｒｃｒｐ表达量逡逑显著提高，并且在２４邋ｈ时ＴＣ２Ｔ的表达量最高（图２．２）。逡逑４０邋ｆ逦＊逡逑３．５邋－逦丨逡逑■逦■逡逑■邋－邋ｉ逡逑ｍｉｌＩＩ邋ａ逡逑0逦１２逦２４逦３６逦４８逦６０逡逑Ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｄｒｕｇ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋（ｈ）逡逑图２．２相同浓度条件下溴氰菊酯诱导不同时间后ｒＣ７Ｔ基因的表达水平逡逑＊邋代表／？＜0．0５。逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＴＣＴＰ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＤＭ邋ｆｏｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑＊邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｐ＜０．０５．逡逑２．３．３不同浓度溴氰菊酯处理细胞的存活率逡逑分别用不同浓度的溴氰菊酯处理细胞２４邋ｈ，然后使用流式细胞仪来检测不同逡逑浓度刺激下细胞的凋亡率。结果显示，在２０邋ｐｐｍ浓度时，细胞的凋亡率最小（图逡逑２．３），该浓度处理下基因ｒＣ７Ｐ的表达量最高，预示７ＩＴＰ在溴氰菊酯耐受中发逡逑挥作用。逡逑１４逡逑

溴氰菊酯,柱状图表,流式细胞仪检测,细胞的

【参考文献】