基于分子模拟的大豆疫霉苏氨酰tRNA合成酶与Borrelidin相互作用机理研究

发布时间：2020-06-16 17:36

【摘要】：大豆疫霉属于卵菌的一种,它所引起的大豆疫病可造成豆科植株等不同程度的腐烂。目前,对大豆疫病的防治主要是采用甲霜灵等化学药剂,但甲霜灵作用位点单一,容易产生抗药性,因此,亟待开发新的抗卵菌药物。微生物天然产物Borrelidin(BN)是以苏氨酰tRNA合成酶(ThrRS)为靶标的大环内酯类化合物,具有抗菌、抗疟原虫和抗癌等活性,但也对人体细胞具有很强的毒性,表明BN的分子结构还存在缺陷,有待于进一步的结构优化和改造。本实验室前期研究显示,BN对包括大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)在内的卵菌具有独特的高抑制活性,其作用靶标为大豆疫霉ThrRS(PsThrRS),但具体作用机制并不明晰。为了明确BN与PsThrRS的相互作用机理,为基于ThrRS为靶标的药物设计和BN的结构改造提供参考信息,本研究采用同源建模的方法以人的ThrRS晶体结构为模板获得了野生型PsThrRS与突变体(截掉编辑区后的截短PsThrRS)三维结构模型,然后分别与BN进行分子对接和动力学模拟鉴定PsThrRS活性中心的氨基酸残基组成,并对野生型和突变型的截短PsThrRS与BN对接的结合自由能进行比较,同时通过点突变明确与BN相互作用的关键氨基酸残基组成,并以此为基础对化合物数据库进行虚拟筛选,为获得潜在抗卵菌药物提供理论依据。本实验主要研究结果如下:(1)首先从NCBI数据库和PDB数据库中获得PsThrRS的氨基酸序列(GenBank:JF727824.1)和人的截短ThrRS晶体结构(PDB code:4HWT,4P3N,4TTV),结合生物信息学中同源建模等分子模拟技术构建了截短PsThrRS的三维结构模型;采用分子对接和动力学模拟手段总结得出野生型PsThrRS活性中心构成BN结合口袋的18个关键氨基酸残基:Ser-410、Gly-411、His-412、His-415、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Phe-565、Tyr-566、Thr-586、Gln-588、Asp-590、Gln-592、Leu-593、His-616、Ala-618,其中15个氨基酸残基在原核生物和真核生物中具有保守性,它们分别是:Gly-411、His-412、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Phe-565、Tyr-566、Thr-586、Gln-588、Asp-590、Leu-593、His-616、Ala-618。此外,动力学模拟结果显示,在PsThrRS中还存在着另外的6个氨基酸与BN存在相互作用,分别为:Pro-438、Arg-478、Phe-482、His-488、Ala-564和Gly-621。分子对接结果显示,在相互作用过程中Arg-466与BN-C30的O31,O32形成双氢键,Gln-484与BN-C30上的O32形成单氢键,Tyr-566与BN-C25羟基形成单氢键,Tyr-566与BN-C13形成σ键和π键组成的共价双键,Asp-590与BN-C13上的羟基形成单氢键,从而使BN稳定地固定在结合口袋中,展现了BN与PsThrRS的深度契合性。通过虚拟突变技术构建的突变型PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A、PsThrRS-Y566A和PsThrRS-G621A分别与BN对接后,其结合能降低了0.1-1.35 kcal/mol,表明氨基酸残基Arg-466、Arg-478、Tyr-566和Gly-621对BN与截短PsThrRS的结合和对底物的催化可能起关键作用。(2)利用点突变技术和重叠PCR成功克隆了PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A和PsThrRS-Y566A三个突变型的表达载体,将实验室已构建的野生型PsThrRS和本研究构建的突变型PsThrRS表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的诱导表达及纯化,通过SDS-PAGE分析,重组菌株在16℃,IPTG终浓度为0.2 mmol/L时可获得最优表达量,并且重组蛋白主要以可溶性形式存在,包涵体形成较少;对诱导破碎后的上清液进行镍柱梯度洗脱、超滤浓缩等纯化处理,发现经70 mM咪唑浓度洗脱液洗脱后,杂蛋白可被洗脱掉,经100 mM咪唑浓度洗脱液洗脱后,目的蛋白可被洗脱下来,最终获得纯度达到了95%以上,浓度达到1 mg/mL的重组PsThrRS。(3)在对野生型PsThrRS基本酶动力学参数的测定后,结合米氏方程曲线,求得ATP的K_m=32.09μM,V_(max)=4.62μM/min,K_(cat)=6.32 min~(-1);Ser的K_m=0.09 mM,V_(max)=4.25μM/min,K_(cat)=5.82 min~(-1);tRNA的K_m=2.68μg/100μL,V_(max)=4.07μM/min,K_(cat)=5.58 min~(-1),PsThrRS对底物ATP的亲和力大于Ser。同时完成了对PsThrRS突变体的酶活性测定并比较了它们与野生型PsThrRS之间酶活性的变化,结果表明突变型PsThrRS-R466A,PsThrRS-R478A和PsThrRS-Y566A的活性分别降低了20.22%、57.80%和58.84%,由此可以判断氨基酸残基R466,R478和Y566在氨酰化反应过程中与底物的催化作用有关,从实验上验证了分子模拟结果的准确性。(4)BN抑制野生型PsThrRS的IC_(50)为4.4 nM,抑制突变型PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A、PsThrRS-Y566A的IC_(50)分别为4.6μM、1.4μM和2.6μM,本研究体系中酶的浓度为0.73μM,相比于野生型PsThrRS表观抑制常数(apparent inhibition constant)K_i~((app))值增加了300-1000倍,即Arg-466、Arg-478和Tyr-566的突变可导致PsThrRS对BN产生很明显的抗性,这也同样验证了虚拟点突变结果的可信性。(5)在CHEMBL的数据库中搜索出37个与BN结构相似性大于70%的小分子化合物,利用分子对接软件AutoDock vina进行虚拟筛选得到30个结合自由能低于BN且与PsThrRS具有亲和力的先导化合物。最终选择了3种对接效果最好而且具有潜在的防治大豆疫霉病的化合物:CHEMBL2349167、CHEMBL2349177和CHEMBL2349166,与BN相比,这三个化合物在五元环C2羧基上的O31分别换成了酪胺酰、苄基和丙氨酰,表明在PsThrRS上与BN五元环C2上的羧基形成双氢键的Arg-466为关键氨基酸。以上研究为新抗真菌药物的开发提供了新的参考和理论指导。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.651
【图文】：

其作用机制orrelidin（BN）最初是从海洋拮抗放线菌发酵液中分离出来的，在生物学功能上表现细菌、真菌，抗疟原虫，杀虫和除草，而且研制血管生成[39-43]。BN 能救治受致命疟原虫侵的 FCR3 菌株和 drugresistant K1 菌株（IC50的抗疟药，包括蒿甲醚，青蒿琥酯和氯喹更为成（IC50：0.8 nM）[46]。在相同剂量下抑制血性肺转移[47]。这些不同的抑制活性都是作用于性抑制苏氨酰 tRNA 合成酶（ThrRS）展现如何同时抑制细菌生长和各种动植物的感染 BN 的单分子分别同时占据着细菌和人 ThrR位点上与氨基酰化相关的的三个底物氨基酸，外“直角”位点（如图 1-1），并通过酶的高]。

二维图,霉素,诱导契合,人类

1.2.1.2 Borrelidin 的作用机理通过详细的结构和功能分析，在研究人类和大肠杆菌 ThrRS 与 BN 结合后的共结晶结构的基础上，确定了一个独特的 BN 抑制 ThrRS 的结构抑制机制：BN 占据着 ThrRS 的结合口袋，对三个底物具有排阻作用（如图 1-2），即 Thr，ATP，tRNA。

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