ABC转运蛋白GCN4对晚疫病抗性的功能研究

发布时间：2020-06-20 23:35

【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上重要的粮食作物,2015年马铃薯主粮化战略的提出也表明它在我国占据越来越重要的地位。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病对马铃薯生产的危害是最为严重的,而选育具有持久抗性的马铃薯品种是解决这个问题最经济环保的方法。因为病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)在不同病原菌中都很保守,而效应子(effctor)进化较快,因此PAMP诱导抗性(PAMP-triggered immunity,PTI)被认为比效应子诱导的抗性(effector triggered immunity,ETI)更加持久,但其抗性诱导机制还需进一步深入研究。本实验室前期研究发现本氏烟中的一个ABC转运蛋白K4CBY0对晚疫病菌分泌的一种PAMP INF1所诱导的细胞坏死反应是必需的。本课题旨在进一步研究该蛋白对晚疫病抗性的功能及作用机制,为马铃薯晚疫病持久抗性育种提供理论及技术支撑。主要研究结果如下:1.通过序列比对确认候选ABC转运蛋白K4CBY0为NbGCN4(GENERAL CONTROL NONREPRESSIBLE 4)。构建了NbGCN4的超量表达载体,分别在本氏烟上通过瞬时超量表达和VIGS沉默NbGCN4后结合晚疫病抗性鉴定实验发现,超量表达NbGCN4使晚疫病抗性降低,而沉默NbGCN4后晚疫病抗性加强,这暗示NbGCN4对晚疫病菌抗性的作用可能是负调控的。2.在本氏烟上通过VIGS沉默NbGCN4之后,在新生叶上瞬时超量表达诱导PTI反应的基因Cf4/Avr4和NIP,以及诱导ETI反应的基因R2/Avr2和R3a/Avr3a,结果发现这些基因诱导的细胞坏死反应都受到了抑制,表明NbGCN4同时参与多种PTI和ETI免疫反应,可能是一个hub基因。此外,构建了NbGCN4的干涉载体,通过遗传转化得到本氏烟干涉株系,经过功能验证发现有三个株系均不能识别INF1诱导的细胞坏死反应,它们可以用于后续进一步的晚疫病抗性机制研究。3.通过qRT-PCR分析StGCN4在经过晚疫病菌14-2接种的马铃薯抗病材料09013、06HE13-1、08HE17H和感病材料93045、E-P-5的叶片中的表达量,发现StGCN4在这五种材料中均能被诱导上调表达,且其表达量在抗感材料中没有显著性差异,暗示StGCN4可能参与植物的基础免疫反应;通过qRT-PCR分析StGCN4在经过不同的PAMPs包括CF、flg22、Pep13和chitin诱导的马铃薯品种E3叶片中的表达量,发现StGCN4对CF的响应最迅速,在0.5 h即显著上调表达,且在后期也一直持续上调表达。此外,StGCN4也能受到Pep13、flg22和chitin的诱导上调表达,但时间稍晚,一般在诱导1 h后,说明StGCN4可以响应不同的PAMPs。另外还通过qRT-PCR分析StGCN4在经过高盐(100 mM NaCl)、高温(35℃)、低温(4℃)以及干旱等非生物胁迫处理的马铃薯材料AC142的叶片中的表达量,发现StGCN4只有在干旱胁迫24h时有显著上调表达,而在其它诱导条件下表达量没有显著变化。以上结果暗示StGCN4可能主要参与生物胁迫的基础防御。4.亚细胞定位实验结果表明NbGCN4位于细胞膜上。CO-IP实验结果显示NbGCN4不与Nb14-3-3互作,说明NbGCN4可能与拟南芥有不同的抗性机制;通过IP-MS进一步筛选NbGCN4的互作蛋白,共鉴定到了22个候选蛋白,预测结果显示其中有3个可能定位于细胞膜上,分别为一个具有LRR结构域的类受体(A0A1S4A328)、一个RNA螺旋酶(A0A0V0IKF4)和一个包含DUF结构域的蛋白(A0A2G2ZM45),它们最有可能与NbGCN4发生直接互作,但还需进一步验证。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.32
【图文】：

蛋白,中高度,免疫反应,相互作用

图 1：植物免疫的原则（Dodds and Rathjen 2010）Fig.1：The principles of plant immunity道 SGT1 是一类 hub 基因，SGT1 是 SKP1 的 G2 等位基因的抑制生物中高度保守，对 PTI 和 ETI 诱导的免疫反应都起着必要o-Orozco et al 2017; Hoser et al 2014; Kadota et al 2010; Liu et al l 2002; Shirasu 2009）。当参与 ETI 时，SGT1 介导 R 蛋白，如 RPI-BLB220、RX123、R3A24、RPS425 和 MLA26，控制其稳定性、平衡（Hoser et al 2014; Hoser et al 2013）。SGT1 通过与其他免疫相ACK1, Rac1, RAR1, HSP90 和 HSC70）相互作用，从而形成多蛋白 et al 2013; Kadota et al 2010; Nakashima et al 2008; Noel et al 2007; Sang et al 2008; Zhang et al 2015）。而 NbGCN4 在 PTI 和 ETI 的免疫信发挥功能还不清楚。

氨基酸序列,氨基酸序列

3.1 GCN4 氨基酸序列分析3.1.1ABC 转运蛋白 K4CBY0 为 NbGCN4本课题所研究的 ABC 转运蛋白 K4CBY0 被注释为 ABC transporter F familymember 4，在研究过程中发现有篇后来报道的蛋白 GCN4 也被同样注释（Kaundalet al 2017）。将 K4CBY0 的 ORF 序列用本氏烟的 cDNA 扩增测序后与 NbGCN4的氨基酸序列利用Geneious 软件进行对比（图 2），结果显示 K4CBY0 与 NbGCN4的氨基酸序列只有 3 个氨基酸序列的差别，其余序列几乎一致。和 NbGCN4 相比，K4CBY0 在第 53 位上多出一个 G，在第 89 位上由 E 变成 D，在第 668 位上由 T 变成 K，其余氨基酸序列全部相同，因此认为 K4CBY0 就是 NbGCN4。三个氨基酸的差异可能是由于扩增植物材料本氏烟的来源不同引起的。

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