BmNPV感染诱导细胞自噬的初步研究

发布时间：2020-06-21 00:12

【摘要】：家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)一种外形呈杆状的细胞核DNA病毒,特异性地感染家蚕细胞(Bombyx mori Linnaeus)。病毒感染后,细胞中病毒蛋白在相对短的时间内大量表达,致使病毒蛋白来不及折叠而大量累积,从而诱发细胞的抗病毒防御反应。自噬就是细胞的一种内在抗病毒防御反应。本研究以家蚕细胞自噬标记蛋白BmGABARAP、BmLC3D及病毒多角体蛋白(polyhedrin)为对象,研究BmNPV感染诱导的细胞自噬。主要结果如下:1.家蚕中自噬相关基因8(atg8)的进化分析及分类以人类ATG8家族蛋白氨基酸序列为搜索序列,在NCBI已公布的273个昆虫物种的部分基因组或全基因组序列中进行BLASTP检索,共检索到208个蛋白序列。利用MEGA7.0软件的MUSCLE法进行多序列比对,GBLOCK软件对不对称序列及多变性序列进行剪切,获得相对保守序列,并用MEGA7.0最大似然算法构建进化树。相对人类ATG8家族蛋白的GATE-16、GABARAP、LC3三个亚家族,昆虫基因组不编码GATE-16,故昆虫ATG8家族蛋白分为2个亚家族:GABARAP亚家族和LC3亚家族。家蚕基因组编码的两个ATG8:BGIBMGA011783-TA和BGIBMGA010251-PA分别属于GABARAP亚家族和LC3亚家族,并分别命名为BmGABARAP和BmLC3D。已有的文献报道表明BmGABARAP是家蚕的一个自噬体标记蛋白。本研究表达了BmLC3D N-端与eGFP的融合蛋白eGFP-LC3D,Western blot实验发现了eGFP-LC3D的II条带,但分子量只有约39.0 kDa;激光共聚焦扫描显微镜发现BmLC3D与BmGABARAP共定位于自噬体。这些结果表明BmLC3D是家蚕基因组编码的另一个自噬体标记蛋白。ATG8家族蛋白在ATG4切割加工后才能在自噬途径中发挥作用。利用定点突变技术分别对BmGABARAP和BmLC3D的G116和G100进行突变,Western blot检测表明第G116和G100位甘氨酸分别为BmGABARAP和BmLC3D的ATG4切割位点。G100突变的BmLC3D在细胞中仍能形成斑点状的自噬体。理论上讲,BGIBMGA010251-PA含245个氨基酸(amino acid,aa)。根据BLASTP分析时对结构域的预测,BGIBMGA010251-PA是一个前体蛋白,含有2个ATG8结构域:(1).aa1-100,与eGFP融合后即为eGFP-LC3D;(2).aa 101-245。该序列被命名为cleaved LC3D(cLC3D)。根据以上实验结果,推测cLC3D也是ATG8家族蛋白新成员。对此仍需进一步验证。2、BmNPV感染诱导自噬发生运用BmGABARAP的兔源多克隆抗体对BmNPV感染诱导的自噬进行了研究。Western blot分析表明,培养基营养成分逐渐损耗(Medium nutrient depletion stress,MND-Stress)时,在32 h时即可检测到微弱的BmGABARAP-II条带,表明细胞培养过程中,随着营养成分的消耗,细胞自噬缓慢增强;构建BmGABARAP(或BmLC3D)与eGFP的融合表达载体,转染细胞48 h后,发现BmGABARAP形成的自噬体成点状结构,而BmLC3D的自噬体几乎不存在。用BmNPV T3感染BmN细胞,在0 h p.i.即能检测到BmGABARAP-II条带,随着BmNPV的持续感染,BmGABARAP-II的量持续增加,表明细胞自噬增强。用荧光显微镜可观察到BmGABARAP及BmLC3D的自噬体,其形状呈空腔状,明显区别于MND-Stress形成的自噬体;且含有自噬体的细胞百分比高于MND-Stress下的百分比。以上结果表明,BmNPV感染BmN细胞可诱导自噬。3.多角体蛋白参与细胞自噬的初步研究研究显示,多角体蛋白和自噬标记蛋白BmLC3D共定位于自噬体;Co-IP显示二者有相互作用,表明多角体蛋白参与细胞自噬,且含有和ATG8相互作用的基序(ATG8 interaction motif,AIM)。利用定点突变技术对预测的多角体蛋白可能的AIM基序中关键氨基酸(W或F)进行突变,Western blot分析表明多角体蛋白的~(47)WDLL~(50)氨基酸片段是多角体蛋白和BmGABARAP相互作用的基序(GABARAP interaction motif,GIM)。多角体蛋白与BmLC3D相互作用的AIM有待进一步研究。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884.51
【图文】：

杆状病毒,进化树,生物杀虫剂

图 1.1 29 种已知杆状病毒的全基因进化树[6]1 Neighbour-joining tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus cor构建是基于 29 种杆状病毒的核心基因的氨基酸序列及基因组序列构建而大于 50%。辅助程序值大于 95%的在分支有标注。ning tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus core genes ofes. The alignment comprised 16349 positions. All branches have bootstrap vues >95% are given along the branches.用毒是已知昆虫病毒的重要组成部分，随着对杆状病毒了解的深入杆状病毒因其宿主特异性，基于此点研发的生物杀虫剂，对于人很好的安全性。20 世纪 30 年代北美开始利用杆状病毒成功防治虫核型多角体病毒作为商品制剂的注册成功都是对杆状病毒作为杆状病毒作为生物杀虫剂相对于化学杀虫剂还是存在杀虫周期长

分类图,自噬,分类图

图 1.3 自噬分类图Figure 1 .3 Schematic representation of the different types of au生过程及分子机制生的显著特征是形成自噬体，因此自噬发生过程通常需要经环境及新陈代谢压力下，mTOR 活性被抑制，ULK1 复合体位于吞噬泡膜上，自噬起始[24]。在两个类泛素化系统的作用关基因（autophagy-related geneAtg）编码的自噬相关蛋白起着 E3 泛素连接酶的作用，帮助 E2 泛素结合酶 ATG3 酯化在自噬体膜的延伸过程中需要降解的蛋白或细胞器在自噬受随着膜的延伸自噬体形成闭合环状双膜结构[29]。紧接着自噬成自噬溶酶体，内部货物被降解成小分子物质，继续参与细

【参考文献】