沙棘木蠹蛾幼虫3种热激蛋白的克隆与表达

发布时间：2020-06-21 22:31

【摘要】：摘要:沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecolus是中国沙棘林危害最严重的钻蛀性害虫,严重影响了沙棘栽种区的生态环境和经济发展。沙棘木蠹蛾主要以幼虫在沙棘根部越冬,其分布区覆盖我国东北、华北和西北大部分地区,幼虫对低温适应的能力非常强。基于热激蛋白(HSPs)可以在低温下修复错误折叠的蛋白质,从而防止细胞损伤和改善耐受性等特点,本文研究了沙棘木蠹蛾幼虫3种热激蛋白基因的序列特征和表达规律,并通过原核表达和免疫印迹试验从蛋白层面研究其表达特点及验证所获得蛋白的表达正确性。在已获得沙棘木蠹蛾转录组数据的基础上,筛选出3种热激蛋白基因,分别为HSP19.7、HSP19.9、HSP70,验证3种基因分别为全长基因;用克隆技术获得其开放阅读框(open read frame,ORF)全长序列并分析其生物信息学特征;运用qRT-PCR技术探寻3种热激蛋白基因在幼虫受到冷刺激时不同组织以及冷刺激后不同恢复时间的表达规律;将全长扩增后测序验证正确的3种热激蛋白基因通过双酶切连接至表达载体pET-30a(+)上,转化大肠杆菌系统中进行原核表达,通过免疫印迹试验检测3种沙棘木蠹蛾热激蛋白。结果如下:1.获得了 3条HSP基因的完整cDNA开放阅读框碱基和氨基酸序列。HSP19.7基因全长ORF为510bp,基因编码169个氨基酸,19.67kDa的分子量;HSP19.9基因全长540bp,编码179个氨基酸,19.9kDa的分子量;HSP70基因全长1896bp,编码631个氨基酸,69.7kDa的分子量。蛋白结构预测显示,在3种HSPs氨基酸序列中都发现典型的热激蛋白分子家族结构特征,其中在HSP70氨基酸序列中找到3个HSP70 家族的签名序列(IFDLGGGTFDVSIL、VVLVGGSTRIPKVQS、IDLGTTYS)及胞质特征序列(EEVD),并分别命名为Eh-HSP19.7、Eh-HSP19.9和Eh-HSP70。多序列比对结果表明3种热激蛋白与多种鳞翅目昆虫的热激蛋白序列含有较高同源性。2.明确了冷刺激后沙棘木蠹蛾4种组织内3种HSPs的表达规律。在25℃常温环境下,沙棘木蠹蛾幼虫的3种HSPs在4个组织间均没有明显表达差异。经-5℃低温处理的幼虫体内,表皮的热激蛋白基因表达量相比未处理的表达量明显上调,具有显著差异。结果证明低温刺激可以促使3种热激蛋白基因在不同组织中上调表达,而表皮是应激反应最为活跃的部位。在冷刺激下,sHSPs在脂肪体中也表现出强烈的反应。3.明确了冷刺激后的恢复期内沙棘木蠹蛾3种HSPs的表达规律。冷刺激后不同恢复时间的3种HSPs在各阶段都有表达,表达量均呈先上升后下降的趋势,且在恢复1-2小时阶段会分别达到峰值,此时和未处理幼虫的表达量存在显著差异。结果证明昆虫在接受低温刺激后,转入相比于该温度更高的正常环境温度,HSPs会先上调,而后由于自身调节会恢复正常生长发育情况下的表达量,这也反映了昆虫的自我调节能力以及低温刺激后的恢复过程有HSPs参与。4.证明了本实验获得的3种HSPs已经准确表达。进一步将3种热激蛋白分别连接表达载体转入大肠杆菌,经IPTG诱导出成功表达的重组蛋白。用SDS-PAGE检测出3种热激蛋白均高效表达,并与预测的重组蛋白分子量相一致。利用制备的多克隆抗体对沙棘木蠹蛾幼虫HSPs蛋白进行免疫印迹试验,结果表明3种热激蛋白能够准确表达。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S763.7
【图文】：

图１－１技术路线图逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑

０邋１００逡逑图３－３沙棘木蠹ＨＳＰ１９．７氨基酸序列结构。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＳＰ１９．７邋ｏｆ邋Ｅｏｇｙｓｔｉａ邋ｈｉｐｐｏｐｈａｅｃｏｌｕｓ逡逑：，＂＂ 逡逑Ｐｆａｍ逡逑■邋？邋＿Ｐ２0逡逑ｍｍ逦—＿逡逑Ｍｉｌｌ——逡逑０邋１００逡逑图３－４沙棘木

本文编号：2724742