黄瓜响应棒孢叶斑病菌侵染的转录组和microRNAs解析

发布时间：2020-06-30 05:30

【摘要】：黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国设施园艺生产中主要蔬菜作物之一。黄瓜棒孢叶斑病是由致病真菌多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的一种世界范围的真菌病害,严重危害我国黄瓜生产。目前关于黄瓜抗棒孢叶斑病的作用机制尚不完全清楚。对棒孢叶斑病菌诱导黄瓜产生的差异表达基因进行研究,将有助于从分子水平上直接了解黄瓜应答病原菌侵染所启动的基因功能,揭示黄瓜防御反应的复杂调控机制,为植物抗病育种工作及植物病害的防御和控制等提供理论依据。本研究利用高通量测序技术,研究了接种棒孢叶斑病菌后抗病黄瓜品种津优38号转录组和microRNA的变化,鉴定到响应棒孢叶斑病菌侵染的关键miRNAs和差异表达基因;并利用黄瓜瞬时过表达技术和TRV诱导的STTM-miRNA沉默技术等手段,进一步证实这些关键miRNAs及其靶基因在黄瓜防御棒孢叶斑病菌侵染中的作用,揭示木质素等次生代谢产物快速合成积累是黄瓜抗棒孢叶斑病的重要机制之一。主要研究结果如下:(1)通过对多个品种的黄瓜接种棒孢叶斑病进行抗病性鉴定,筛选出津优38号属于高抗品种,而露地先锋为感病品种。利用PCR技术对接种棒孢叶斑病后抗、感品种黄瓜叶片进行病原菌快速检测,最早可以在接种后6 h在所有品种叶片组织中检测到入侵的棒孢叶斑病菌。对接种棒孢叶斑病菌后的抗、感品种黄瓜叶片进行活性氧和木质素组织化学染色,发现在接种后6 h到24 h时,抗病品种中的木质素和活性氧含量要明显高于感病品种,可以更快速响应病原菌的胁迫。(2)对抗病品种黄瓜津优38号接种棒孢叶斑病菌0 h、6 h和24 h的叶片进行转录组测序。通过多时间点比较(0 hpi vs 6 hpi和6 hpi vs 24 hpi)筛选差异表达基因,两组交集中共有146个差异基因。从这些差异基因中选取了17个可能与黄瓜响应棒孢叶斑病菌侵染有关的基因进行归类,这些基因涉及了植物激素、转录因子、代谢、Ca~(2+)信号通路、次生代谢相关和防御类基因。同时,利用qRT-PCR方法分析黄瓜抗、感品种之间的基因差异表达模式,发现在抗病品种津优38号中次生代谢相关的基因会被棒孢叶斑病菌强烈的诱导表达。(3)miRNA测序共鉴定了34个差异表达的已知miRNAs,它们分属于17个不同的miRNA家族。结合黄瓜基因组信息和转录组测序数据,并根据靶基因功能进一步筛选出8个可能与抗黄瓜棒孢叶斑病相关的miRNAs;同时,鉴定了7个可能与抗病相关的新miRNAs,这些新预测miRNAs的靶基因均为转录组分析中的差异表达基因,且多与次生代谢有关。(4)通过In-fusion技术构建表达载体,并利用烟草GUS染色验证了miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7对其相应的靶基因NAC、APE、4CL和PAL的负调控关系。在黄瓜子叶中瞬时过表达后接种棒孢叶斑病菌观察表型,发现过表达NAC、APE、4CL和PAL可以提高黄瓜抗病性,过表达miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7会降低黄瓜的抗病性。木质素测定结果表明过表达4CL和PAL会提高黄瓜木质素含量,而过表达Novel-miR1和Novel-miR7会降低木质素含量,说明Novel-miR1和Novel-miR7对4CL和PAL的调控会影响木质素含量进而影响黄瓜的抗病性。(5)成功构建了TRV诱导的STTM-miRNA沉默载体,并对目标miRNA进行沉默,抗病性鉴定和活性氧及木质素代谢相关的生理指标测定结果表明,沉默候选miRNAs可以提高黄瓜抗病性。其中沉默Novel-miR1和Novel-miR7的株系中木质素含量有显著上调,再次验证Novel-miR1-4CL和Novel-miR7-PAL能通过调控黄瓜木质素含量变化而影响黄瓜对棒孢叶斑病的抗性。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.421.1
【图文】：

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图 1-1 植物 miRNAs 的生物合成示意图Fig. 1-1 Biogenesis mechanism of plant miRNAs物中的作用机制具有多种生物学功能，可以参与调控植物的生长应答等。植物中 miRNAs 的作用机制一般存在两mallinterferingRNAs,siRNAs）相似，植物 miRN5’端残基可以和靶 mRNA 的开放读码框（open r互补配对进行切割降解，从而使靶 mRNA 无法（Johnson et al., 2005; Khraiwesh et al., 2012; 伊六NAs 与靶 mRNA 结合不完全匹配，进而抑制 mRck et al., 2000）。在 miRNAs 抑制翻译过程中，ntranslatedregion,UTR）结合并改变 mRNA 上核链来抑制 mRNA 的翻译。也有研究发现植物 mi和靶基因 APETALA2 的 ORF 区完全互补，但并不LA2 的翻译抑制，说明 miRNAs 作用机制中的切

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