利用tasiRNA介导的基因沉默技术验证抗病毒基因GmNH23的功能

发布时间：2020-07-02 04:53

【摘要】：植物能够对入侵的病原体产生防御反应,包括生物、化学和物理系统性防御。在生物系统性防御中依赖一类最重要的R(Resistance)基因编码的R蛋白,它可以特异性识别特定病原体,以激发植物的防御反应。R基因分为多种类型,其中NBS-LRR类型是植物基因组中最大的基因家族之一,而TIR-NBS-LRR类型的抗病基因又是其中的一大类,包括烟草N基因、拟南芥RPS4基因等。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是大豆的严重病害,但对其抗病基因的研究尚属滞后。大豆GmNH23基因也属于TIR-NBS-LRR类型,与抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草N基因同源,本实验室在前期研究中利用本氏烟草瞬时过表达系统验证了GmNH23基因对TMV和SMV都具有一定的抗性。然而,GmNH23基因在稳定过表达植物中的抗病毒活性及其在大豆中的抗病毒功能尚未进行研究。因此本论文从这两方面对GmNH23基因的功能做了深入研究。首先,我们得到了GmNH23基因过表达(GmNH23-Ox)转基因本氏烟草,验证其对TMV和SMV均具有抗性,进一步证实了GmNH23基因对这两种病毒的抗性。反式作用小干扰RNA(trans-acting siRNA,tasiRNA)是一类由特异的MicroRNA介导产生的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),能够通过转录后基因沉默来抑制中靶标基因的表达。因此我们利用tasiRNA干扰大豆GmNH23基因的表达来验证其抗SMV和TMV的功能。本研究利用产生内源tasiRNA的miR1514a设计并构建了干扰载体pKGWRR-tasiRNA-GmNH23。首先通过17wt和rdr6 silence本氏烟草中瞬时表达法验证了tasiRNA-GmNH23对靶标基因的沉默作用。然后,分别在GmNH23-Ox本氏烟草、中抗大豆品种合丰55号、高抗大豆品种科丰1号叶片中瞬时表达tasiRNA-GmNH23,结合病毒侵染实验证明了GmNH23对TMV和SMV的抗性。发根农杆菌介导的毛根转化法在豆科植物中被广泛应用。由于siRNA能够通过维管组织从植物的根部运输到叶片组织,所以本研究利用毛根转化法在大豆根部表达了tasiRNA-GmNH23。在高抗大豆品种科丰1号根组织中表达的tasiRNA-GmNH23不仅沉默了根组织中GmNH23基因的表达,同时也降低了叶片中GmNH23基因mRNA的水平。GmNH23基因的沉默导致了叶片中SMV病毒积累量的增加,最终也证明在大豆中GmNH23具有抗SMV的功能。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.2
【图文】：

BPMV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）、花生斑驳病毒（Peanut mottle virus,CMV）、菜豆黄化花叶病毒（Bean yellow mosaic virus, BYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）等[2]。其中，大豆花叶病毒病对大豆的产量和品质均可造成较为严重的危害。由于 SMV 分布广泛、危害较重、化学药剂难以防治，一直都是大豆种植面临的主要问题。因此，筛选新的抗病种质并发掘新的抗病基因是拓宽大豆抗病遗传基础和成功培育抗SMV 品种的关键[1]。SMV 是马铃薯 Y 病毒属中的成员，其基因组是由正义单链 RNA 组成，能编码至少 10种蛋白质（图 1.1）。SMV 分离株在美国被分为 7 种不同的病毒株（G1 至 G7），而在中国，SMV 的 21 种病毒株（SC1 至 SC21）已被分类[3]。其中有一些 SMV 株系会引起大豆较为严重的病征，例如，东北 SMV-N（Necrosis）病毒株系[4]。其传播方式主要有两种，其中一种是种子本身带有病毒；另一种是以昆虫为介体进行传播。而本研究所用的病毒株是大豆花叶病毒 N1 株，它能使感染的大豆出现较明显的表征：叶片出现皱缩、卷曲、黄化等症状甚至能导致植株的死亡。

来控制[6]。目前，已经从几种模式植物中鉴定出了很多 R 基因码多种蛋白质结构域，主要包含跨膜结构域（transmembranedom白激酶结构域（serine/threonine protein kinases, PKs）、核nding site, NBS）和富含亮氨酸重复（leucine-rich repeat, LRR）结构域，分别是 NB 结构域和 LRR 结构域即 NBS-LRR 结构于 N 末端结构特征细分为：白细胞介素受体-1（Toll InterleukBS-LRR 结构域和包含卷曲螺旋结构域(coiledcoil，CC) 的 CC所示）[8]。而每种结构域都有其相应的功能。例如， NBS 可以结合的 ATP 或 ADP 的存在可以确定 R 蛋白是否处于活性或有约 20-30 个亮氨基酸残基串联重复序列的基本特征[9]。LRR 能病信号的传递，从而诱导防卫基因的表达[10]。TIR 在动物和植。在植物中，它能感知病原体然后引发植物的防御反应，其中反应（hypersensitive response，HR）[11]。

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本文编号：2737764