热激蛋白Hsc70-2和Hsp17.6在甜菜黑色焦枯病毒侵染过程中的功能分析

发布时间：2020-07-02 00:34

【摘要】：热激蛋白(heat shock proteins,Hsp)是一类受胁迫而诱导大量表达的蛋白质,普遍存在于植物和动物细胞中。作为分子伴侣的核心成分,Hsp在生长发育过程中负责蛋白质的折叠、组装、转运和降解,在维持细胞稳态中发挥重要作用。近年来,Hsp70被发现广泛参与到病毒的侵入、解聚、复制、运动、基因表达和病毒粒子形成等过程中,但Hsp70与病毒不同组分的互作如何协同调控病毒的复制循环仍有待深入研究。小热激蛋白(sHsp)参与病毒侵染的报道较少,多见于动物病毒的研究,sHsp如何调控植物病毒侵染及其分子机制仍不清楚。基于此,本研究以甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)为材料,对CP、p23和Hsc70-2三者的互作关系及其如何调控病毒侵染进行了较深入地探索,并对Hsp17.6在BBSV侵染中的功能进行了初步分析。本实验室前期的研究发现,Hsc70-2存在于BBSV外壳蛋白(coat protein,CP)和复制辅助蛋白p23的免疫共沉淀复合物中,在此基础上,本研究首先克隆了本生烟(Nicotiana benthamiana)Hsc70-2基因,利用pull-down、双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)和萤火虫荧光素酶互补成像(LCI)等实验技术,证明Hsc70-2分别与CP和p23直接互作,而CP和p23之间不存在相互作用,且三者不能通过Hsc70-2形成复合体。Hsc70-2与CP互作发生在细胞质中且形成较大的聚集体,Hsc70-2与p23互作发生在内质网衍生的聚集体中。Pull-down和BiFC结果表明,CP和p23都结合Hsc70-2的核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain,NBD)。BBSV侵染温和地诱导Hsc70-2表达上调,超表达Hsc70-2促进BBSV在本生烟中的侵染;相反,下调Hsc70-2的表达则严重影响BBSV的复制水平,说明Hsc70-2是BBSV复制所必需的宿主因子。侵染实验发现,CP负调控病毒的复制,破坏CP的RNA结合活性,病毒(BBSVmMP/CP△N21)的复制水平仍显著低于CP缺失突变体(BBSVmMP/mCP)的复制水平,说明CP负调控BBSV的复制还可能存在其他机制。超表达Hsc70-2能降低CP对病毒复制的抑制作用,竞争实验表明CP干扰Hsc70-2与p23间的相互作用,暗示CP的表达会影响病毒复制复合体的形成。这些研究结果表明,BBSV可通过不同组分劫持Hsc70-2这一寄主因子,进而调控病毒的复制和侵染,这为深入理解Hsp70家族蛋白在病毒侵染中的不同作用提供了新的视角。本实验室前期还发现BBSV侵染诱导Hsp17.6上调,沉默Hsp17.6则会降低病毒在本生烟中的侵染。在此基础上,本研究通过热稳定实验证明HsP17.6确实具有分子伴侣活性,组织特异性表达分析显示Hsp17.6主要在植物的种子中表达,其次是植物的根和叶。亚细胞定位分析表明Hsp17.6定位于细胞质,形成大小不一的聚集体且部分聚集体在细胞内会发生移动,有意思的是,BBSV侵染使得Hsp17.6的定位由聚集体形式变为均匀分布,结合BBSV侵染诱导Hsp90上调表达、共表达Hsp90引起Hsp17.6发生类似的定位改变等实验结果,我们认为Hsp17.6定位的变化可能是由于BBSV侵染诱导Hsp90上调表达而间接引起的。超表达Hsp17.6蛋白并不能促进BBSV的侵染,沉默Hsp17.6减弱BBSV的侵染但不影响病毒的复制,暗示Hsp17.6可能在病毒的运动中起作用。BiFC和pull-down实验表明,Hsp17.6与BBSV的运动蛋白p7a存在相互作用;BiFC和Co-IP实验也证明,Hsp17.6与Actin互作,这些实验结果初步表明Hsp17.6可能在介导BBSV运动复合体沿着Actin的运动中发挥重要作用。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41
【图文】：

内质网,伴侣,插图,病毒侵染

Ｈｓｐ｜：Ｐｉ邋卜－逡逑Ｉ、人逡逑Ｈ0ｐｔ逡逑Ｈｓｐ９０逡逑图１－１邋Ｈｓｐ７０的分子伴侣功能循环模型（Ｍａｙｅｒ，２００５）逡逑当Ｈｓｐ７０结合ＡＴＰ时，其对底物的亲和力较低，有利于折叠至天然构象的蛋白质的释放并快速加载变性的蛋白质，逡逑辅助分子伴侣ＪＤＰ促进Ｈｓｐ７０水解ＡＴＰ引起Ｈｓｐ７０构象发生改变，此时Ｈｓｐ７０紧密地结合底物并进行蛋白质的逡逑折叠。在核苷酸交换因子的作用下，Ｈｓｐ７０上ＡＤＰ－ＡＴＰ快速交换，同时使Ｈｓｐ７０回到最初的构象，释放折叠好的逡逑蛋白质并开始新的伴侣功能循环。在辅助分子伴侣Ｈｏｐ的帮肋下，Ｈｓｐ７０可与Ｈｓｐ９０协同作用促进变性蛋白质的逡逑重新折叠。蓝色图形表示Ｈｓｐ７０，黄色线条表示底物蛋白。逡逑许多病毒侵染能诱导宿主细胞大量表达Ｈｓｐ７０邋（Ｃｈｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８ｂ；邋Ｎａｇｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ逡逑ｅｔａｌ．，２００９；Ｙａｏｅｔａｌ．，２０１７），表明Ｈｓｐ７０在病毒侵染中发挥重要作用。Ａｐａｒｉｃｉｏ等人提出诱导表达逡逑Ｈｓｐ７０可能与病毒ＲＮＡ的复制不是直接相关的

过程图,番茄丛矮病毒,复制酶,预组装

Ｈｓｃ７０，缺失ＳＧＴＡ增强ＳＶ４０与Ｈｓｃ７０的亲和力，但这不利于ＳＶ４０有效地释放到细胞质中。超逡逑表达ＳＧＴＡ促进Ｈｓｃ７０对底物的结合从高亲和的ＡＤＰ－Ｈｓｃ７０态向低亲和的ＡＴＰ－Ｈｓｃ７０态的转变，逡逑这不利于病毒粒子结合内质网上的Ｈｓｃ７０，因此也不利于ＳＶ４０高效地释放到细胞质中（图１－２）。逡逑ＳＧＴＡ如何适时地促进与减弱Ｈｓｃ７０与病毒粒子的亲和力尚不清楚。此外，Ｈｓｐｌ０５、Ｈｓｃ７０和Ｊ蛋逡逑白协同作用组成解聚机器（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋ｍａｃｈｉｎｅｒｙ），负责清理细胞内聚集的蛋白质，这种解聚逡逑机器可能被ＳＶ４０劫持以促进其进入宿主细胞（Ｒａｖｉｎｄｒａｎｅｔａｌ．，２０１５）。目前尚没有Ｈｓｐ７０家族蛋逡逑白调控植物病毒侵入细胞的报道。逡逑１．１．１．２Ｈｓｐ７０调控病毒的解聚、组装与释放逡逑Ｈｓｐ７０在动物病毒的解聚、组装和释放等过程中都起重要的作用。在多瘤病毒感染３邋ｈ时，逡逑Ｈｓｐ７０就能与病毒粒子ＶＰ１结合，同时在体外实验中，Ｈｓｐ７０以水解ＡＴＰ提供的能量有效地促进逡逑多瘤和乳头瘤病毒样颗粒和病毒粒子解聚（Ｃｈｒｏｍｙ邋ｅｔａｌ．，２００６）。Ｉｖａｎｏｖｉｃ等人利用网织红细胞裂逡逑解物重现完整的５分子的释放。在这个系统中，用Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０抗体封闭Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０减少了邋５逡逑的释放

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