TbCSV及其卫星TbCSB来源的部分siRNA功能研究

发布时间：2020-07-01 23:10

【摘要】：烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的单组分病毒,经烟粉虱(Bemisia tabaci)传播,在番茄和烟草上可引起严重的曲叶病,造成严重经济损失。vsiRNAs(virus-derived small interfering RNAs)介导的RNA沉默主要靶向病毒自身基因组和寄主的mRNA对其进行转录后水平的调控。本试验以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为试验材料,研究TbCSV及其伴随卫星(Tobacco curly shootβsatellite,TbCSB)病害复合体来源的vsiRNAs在病毒侵染过程中的作用,试验结果将有助于解析TbCSV/TbCSB诱导寄主产生典型症状的作用机制。为验证TbCSV/TbCSB复合侵染本氏烟后是否产生vsiRNAs,本研究利用小RNA测序技术对TbCSV/TbCSB复合侵染后本氏烟、TbCSV单独侵染后本氏烟进行小RNA测序分析,结果显示,TbCSV/TbCSB处理组中共测得1165882条vsiRNAs,特异的有87315条;TbCSV处理组中共测得217272条vsiRNAs,特异的有32192条。在两组处理中来源于TbCSV和TbCSB的vsiRNAs大小均主要为21 nt和22 nt,主要分布于TbCSV和TbCSB编码蛋白的开放阅读框(open reading frames,ORFs)内,且首位碱基主要为尿嘧啶(Uracil,U)。对vsiRNAs的产生热点分析显示,TbCSV/TbCSB复合侵染的TbCSV基因组上共有55个热点,在TbCSB上共有17个热点;TbCSV单独侵染的TbCSV基因组上共有49个热点。本试验选取了55个reads数超过2000的来源于TbCSV/TbCSB复合侵染的TbCSV来源的vsiRNAs与各个基因mRNA的发夹结构序列进行比对,得到19个来源于TbCSV mRNA的发夹结构的小RNA。进一步利用RT-PCR技术克隆获得14个vsiRNAs。为了验证病毒产生的vsiRNAs是否在病毒侵染过程中起作用,我们将验证得到的14个vsiRNAs分别构建至甘蓝曲叶病毒(Cabbage leaf curl virus,CaLCuV)表达载体(pCVA)中,经农杆菌EHA105介导在本氏烟体内表达,分析vsiRNAs表达后对本氏烟植株生长的影响。结果显示,其中有3个vsiRNAs表达后造成本氏烟生长异常,分别命名为Y35A8、Y35A14、Y35A18。Y35A8表达后本氏烟叶片向下卷曲并有黄脉症状;Y35A14表达后本氏烟心叶严重向下卷曲且伴有黄脉症状,下部叶片也有轻微黄脉症状;Y35A18表达后本氏烟上整个顶部叶片卷曲并有黄脉症状。为进一步研究vsiRNA Y35A8、Y35A14、Y35A18表达后对病毒侵染的影响,分别在这3个小RNA表达15 d后接种TbCSV/TbCSB侵染性克隆,接种8 d和45 d后,观察本氏烟的表型变化,并用qPCR方法分析病毒积累量。结果显示,与未表达vsiRNA植株相比较,表达这3个vsiRNA的本氏烟上病毒症状更加严重,主要表现为严重的叶片卷曲以及茎秆扭曲;qPCR检测病毒积累量,结果显示,在表达Y35A8的本氏烟上,病毒积累量比对照组高而卫星积累量比对照组低;在表达Y35A14的本氏烟上,病毒和卫星的积累量均比对照组高;在表达Y35A18的本氏烟上,病毒积累量前期比对照组高而后期比对照组低,卫星积累量前期比对照组高而后期与对照组基本一致。以上结果说明病毒来源的vsiRNAs在病毒侵染过程中对寄主和病毒都产生了影响。为了研究Y35A8、Y35A14、Y35A18是否靶向寄主mRNA从而行使功能,我们结合psRNATarget靶基因预测网站和RT-qPCR方法验证到有4个靶基因符合小RNA负调控,表达下调;分别命名为Y35A8-6、Y35A14-2、Y35A14-3、Y35A18-8。靶基因Y35A8-6 ID为Niben101Scf04410g04006.1,属于蛋白酶抑制子家族基因;靶基因Y35A14-2 ID为Niben101Scf23557g00007.1,属于亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶基因家族基因;靶基因Y35A14-3 ID为Niben101Scf03194g01005.1,为跨膜转运蛋白家族基因;靶基因Y35A18-8 ID为Niben101Scf03009g05001.1,为富亮氨酸重复序列家族基因。我们进一步利用烟草脆裂病毒(Tabacco rattle virus,TRV)介导这4条基因下调表达从而研究其对寄主和病毒的影响。结果显示,分别将这4条基因沉默后的处理组植株的表型与对照组植株相比没有差异;基因沉默10 d后继续接种TbCSV/TbCSB第10 d,基因Y35A8-6、Y35A18-8处理组上病毒侵染会造成顶端叶片卷曲较对照严重,基因Y35A14-2、Y35A14-3处理组上与对照相比表型没有差异;qPCR结果显示,处理组中TbCSV和TbCSB的积累量均比对照要低。以上研究表明,TbCSV/TbCSB侵染本氏烟后产生vsiRNAs,且部分vsiRNAs会影响寄主的正常生长和协助病毒侵染并造成较严重症状,以及增强病毒在寄主中的积累量,表明其可能参与了病毒与寄主的互作过程。此外,qPCR分析得到的4条靶基因下调表达后导致病毒和卫星的积累量降低,表明其对病毒的侵染和复制也造成了影响。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.72

【参考文献】

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本文编号：2737407