CSBV感染中蜂后小RNA差异表达及CSBV编码的MD17功能研究

发布时间：2020-07-04 22:08

【摘要】：目的本研究通过Illumina高通量测序和生物信息学的方法,对感染CSBV的中华蜜蜂幼虫和健康的中华蜜蜂幼虫小RNA(s RNA)进行测序,分析和预测宿主mi RNA的差异表达、源于CSBV的si RNA(vi RNA)及其潜在的病毒mi RNA(vmi RNA),并筛选一条vmi RNA(MD17)对其功能进行初步研究,为深入研究中华蜜蜂抗CSBV病毒机制及其CSBV vmi RNA功能研究奠定基础。方法通过高通量测序技术对构建的CSBV感染的中华蜜蜂幼虫(L_I)和健康中华蜜蜂幼虫(L_H)的两个文库进行测序,测序数据过滤后,使用Bowtie软件对两个文库的s RNA长度和分类进行注释,以mi RBase作为参考,通过DEGseq(2010)软件对宿主已知mi RNA表达水平进行聚类分析,并通过mi REvo和mirdeep2预测软件预测宿主的新mi RNA。同时将得到的clean reads定位于CSBV基因组,预测病毒的vi RNA,通过RNAhybrid预测病毒vi RNA靶基因,并且使用VMIR软件预测其潜在的mi RNA。在此基础上,对宿主mi RNA和病毒vi RNA的靶基因进行GO功能富集和KEGG PATHWAY富集分析。利用q RT-PCR方法对预测的病毒vmi RNA前体进行检测和验证。同时针对靶向基因VP2的vmi RNA MD17功能进行研究,首先参照MD17成熟体序列合成si RNA,然后将si RNA与p EGFPN1-CSBV-VP2重组表达质粒共同转染至293T细胞中,在细胞水平上研究MD17对CSBV VP2基因表达的影响。在此基础上,将MD17(1μg/μL)和1×107拷贝数的CSBV共同饲喂3日龄中华蜜蜂幼虫,通过q RT-PCR检测幼虫体内CSBV拷贝数,并统计幼虫存活率,对MD17在CSBV感染过程中的作用进行初步探讨。结果经高通量测序,L_H和L_I两个文库分别获得14,933,703和18,687,476条clean reads,长度分析结果显示,其主要集中在22nt处,符合mi RNA的长度特征。将所获s RNA进行分类注释,共鉴定出151个已知的宿主mi RNA前体和预测到2个新的宿主mi RNA,同时也检测到了源于CSBV正义链的s RNA有882,573个,负义链的s RNA有74,214个,表明感染期间CSBV基因组正义链和反义链均可产生s RNA。在此基础上,对L_H和L_I两个文库的宿主mi RNA表达水平进行聚类分析,发现共有44个宿主mi RNA表达显著差异,其中有26个mi RNA表达上调,18个mi RNA表达下调,经过功能分析显示这些mi RNA靶基因多为调控蛋白和参与信号传导的蛋白,并以此调控代谢途径、胞吞作用以及m RNA的降解等。通过与CSBV基因组比对分析,共鉴定出源自CSBV的vi RNA146,960个,其中差异表达的vi RNA 311个,对其靶基因进行功能分析显示,靶向病毒的vi RNA靶基因主要与病毒感染相关,而靶向宿主的vi RNA靶基因具有与信号转导相关酶(如GTPase酶、蛋白激酶等)结合的功能,并主要参与了宿主的代谢途径,其次还有少量的靶基因参与了宿主的胞吞作用以及RNA降解。通过Vir-Mir软件预测得到6条源于CSBV的vmi RNA前体,并通过q RT-PCR方法在感染CSBV幼虫体内检测到6条vmi RNA前体,测序结果均与预测的序列完全匹配。进一步分析发现,MR3、MD17定位于结构蛋白基因,MR10、MD18、MD27、MD35定位于非编码区。对靶向VP2基因的MD17在CSBV感染中的功能研究结果显示,MD17可以在293T细胞中抑制CSBV VP2基因的表达,且经流式细胞仪检测干扰效果接近40%,而饲喂MD17后的幼虫体内CSBV拷贝数在各时间点均低于CSBV感染组,同时幼虫存活率也明显上升,与CSBV感染组相比差异极显著(P0.01),表明通过干扰MD17的产生,能够影响CSBV在中华蜜蜂幼虫体内的复制。结论1、共鉴定出151个已知宿主mi RNA和2个宿主新mi RNA,并且发现中华蜜蜂幼虫在感染CSBV后,宿主mi RNA的靶基因主要参与调控代谢途径、胞吞作用以及m RNA的降解。2、预测到146,960个病毒vi RNA,6个潜在的vmi RNA,并且靶向病毒的vi RNA基因主要与病毒感染相关,而靶向宿主的vi RNA基因主要参与了宿主的代谢途径,其次还有少量的靶基因参与了宿主的胞吞作用以及RNA降解。同时在感染CSBV的幼虫体内检测到6条病毒vmi RNA前体,并通过测序结果证明了它们均源自CSBV。3、针对MD17设计si RNA进行RNAi干扰,能够抑制CSBV在中华蜜蜂幼虫体内的复制,推测MD17可能在机体防御CSBV感染过程中发挥着重要作用。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S895
【图文】：

原理图,文库构建,原理图,蜜蜂

为 Dicer 酶切割的结果，siRNA 集中在 24 nt，piRNA 集RNA 与参考序列比对分析及其分类注释owtie 将 sRNA 与蜜蜂和 CSBV 基因组进行比对，分析其分布，为了了解感染和未感染 CSBV 幼虫中 sRNA 的种类s 与各类 RNA 比对，按照 known miRNA > rRNA > tRNArepeat > > novel miRNA 的优先级顺序进行分类注释。通 virus 的读数，即若 read 序列长度的 50%位于成熟体位置s 的 reads，或初步的 reads 属于蜜蜂参考基因组的非比对里的 other 中的 reads 则保留为最终的鉴定的 virus 的 rea

长度分布,文库,数据过滤,长度分布

表 1 RNA 文库数据过滤表类型 L_H L_ITotal reads 15,366,167 (100.00%) 19,186,693 (100.00%)N% > 10% 634 (0.00%) 0 (0.00%)low quality 3846 (0.03%) 8,594 (0.04%)5 adapter contamine 5210 (0.03%) 10,849 (0.06%)3 adapter null or insert null 332,614 (2.16%) 453,481 (2.36%)with ployA/T/G/C 90,160 (0.59%) 27,293 (0.14%)clean reads 14,933,703 (97.19%) 18,687,476 (97.40%)

【相似文献】