烟粉虱唾液蛋白Bt56靶向植物蛋白NTH202调控植物水杨酸途径

发布时间：2020-07-07 05:03

【摘要】：烟粉虱Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)是半翅目粉虱科的一类重要的农业害虫。近年来,Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)、Mediterranean(MED)烟粉虱入侵危害,已对我国农业生产造成了严重影响。作为一种刺吸式口器植食性昆虫,烟粉虱在取食寄主植物韧皮部汁液的同时分泌唾液帮助取食并调控植物的防御反应。截止到目前为止,只有少数刺吸式口器植食昆虫的唾液蛋白被鉴定,更为重要的是,这些蛋白的功能及调控植物防御反应的作用与机理仍不清楚。因此,本文探究了烟粉虱唾液蛋白Bt56在烟粉虱-植物互作中的作用及其调控植物水杨酸信号途径的部分机制。实验室前人研究表明,烟粉虱的唾液蛋白Bt56是一个含有信号肽的小分子蛋白,在烟粉虱唾液腺主腺中特异性表达,能够通过诱导植物水杨酸(salicylic acid)信号途径促进烟粉虱在烟草上的存活。本研究通过酵母双杂交实验发现MED,MEAM1,Asia Ⅱ 1,Asia 113和China2等多个隐存种的烟粉虱唾液蛋白Bt56均能够与烟草NTH202互作,并进一步对MED烟粉虱中的Bt56通过GST Pull-down和双分子荧光互补(BiFC)的手段进一步进行了验证。烟粉虱取食和过表达Bt56均显著降低烟草中NTH202基因的表达水平。通过VIGS(virus induced gene silencing)的方法沉默烟草中NTH202基因对烟草的表型没有明显影响,但显著提升烟粉虱在烟草上的存活率和产卵量。未被烟粉虱取食时,沉默NTH202基因的烟草中水杨酸含量与对照烟草相比没有显著差异;烟粉虱取食后,沉默NTH202基因的烟草和对照烟草中的水杨酸含量均显著上调,但沉默NTH202基因的烟草中的水杨酸含量显著高于对照烟草中的水杨酸含量。因此,我们推测NTH202除了在烟草中发挥其作为转录因子调控植物基因表达的作用外,可能在烟草中还有其他未知的功能,烟粉虱在长期的进化中获得了保守地调节该蛋白的功能的能力,即分泌Bt56调节NTH202功能,从而帮助烟粉虱更好的取食。综上所述,本研究发现了一个能与烟粉虱唾液蛋白Bt56互作的烟草NTH202蛋白,初步解析了其在烟粉虱-植物互作中的作用。本研究初步揭示了烟粉虱唾液效应因子Bt56调节寄主植物水杨酸信号途径的机制,这对我们了解烟粉虱的入侵机制、选育抗虫作物品种、发展新型烟粉虱的防控策略具有重要的指导意义。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.3
【图文】：

酵母双杂交,酵母菌株,共转

学位论文逦烟草内与烟粉虱Ｂｔ５６蛋白互作蛋白的筛选与８０），邋ＭｔＫＮ０Ｘ４邋（ＡＢ０３３４８１），邋ＭｔＫＮＯＸ５邋（ＡＢ０３３４８２），邋ＭｄＫＮＡＰ３邋（Ｚ７１９８０），逡逑Ｂ０２５７１４），邋ＮＴＨ２２邋（ＡＢ０２５７１５），邋ＮｔＨ２３邋（ＢＡＡ２５９２１），邋ＮｔＨ２０１邋（ＢＡＦ９５７７６），邋Ｏｓｈ４５２），邋ＬｅＴ１２邋（ＡＡＣ４９９１８）．逡逑验证结果显示共转ｐＧＢＫＴ７－Ｂｔ５６与ｐＧＡＤＴ７－ＮＴＨ２０２酵母菌株能够在四缺ｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，补充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并变蓝，相反５６和ＡＤ的酵母菌株和共转ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培图３．２），说明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特异性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑

蛋白质序列,烟粉虱,互作,酵母菌株

基（ＳＤ／－Ａｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，补充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并变蓝，相反的共逡逑转ＢＤ－Ｂｔ５６和ＡＤ的酵母菌株和共转ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培养基逡逑上生长（图３．２），说明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特异性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑ＢｋＡＪ邋ＢＭＷ逡逑图３．２酵母双杂交验证Ｂｔ５６与ＮＴＨ２０２间蛋白互作逡逑Ｆｉｇ．邋３．２邋ＮＴＨ２０２邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑烟粉虱是一个具有超过３０个隐种复合体的物种（ＤｅＢａｒｒｏｅ／ａ／．邋２０１１；邋Ｄｉｎｓｄａｌｅｄａ／．逡逑２０１０；邋Ｌｉｕｅ／ａ／．邋２０１２；邋Ｆｉｒｄａｕｓ邋扣ａ／．邋２０１３；邋ＨｕｅＭ／．邋２０１４）。徐红星（２０１５）从邋ＭＥＡＭ１，逡逑Ａｓｉａ邋ＩＩ邋３，Ａｓｉａｌｌ邋１邋和邋Ｃｈｉｎａ邋２邋四种粉虱中克隆了仇５６邋基因（ＧｅｎＢａｎｋ：邋ＫＹ９８６８７０，逡逑ＫＹ９８６８７１，邋ＫＹ９８６８７２，邋ＫＹ９８６８７３），通过分析表明以上４个隐种的Ｂｔ５６蛋白质序列都逡逑具有预测的信号肽，并且序列比对显示出高度相似性。于是我们分别构建了对应的诱饵载逡逑体

互作,融合蛋白,蛋白质印迹

ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ实验使用２肫ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白来下拉２陴的ＭＢＰ或逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白。使用抗ＭＢＰ抗体进行蛋白质印迹以检测相关蛋白质，用考马斯逡逑蓝染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶以监测输入蛋白量。如图３．３所示，经ｐｕｌｌｄｏｗｎ分析，ＮＴＨ２０２逡逑可与Ｂｔ５６在体外发生互作。逡逑ＧＳＴ邋ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ逦Ｉｎｐｕｔ逡逑ＧＳＴ邋＋逦＋逦－逦＋逦＋逦－逦－逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６逦－逦－逦＋逦＋逦－逦－逦＋逦＋逡逑ＭＢＰ逦＋逦－逦＋逦－逦＋逦－逦＋逦－逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２逦－逦＋逦－逦＋逦－逦＋逦－逦＋逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２逦—逦—＊逡逑ＭＢＰ逦逦邋一逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６逦４／０逡逑ＧＳＴ逡逑Ａｎｔｉ－ＭＢＰ逦Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ邋ｂｌｕｅ逡逑图３．４邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ验证Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２的体外互作。利用ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白逡逑对ＭＢＰ或ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白进行Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ分析。ＧＳＴ结合珠清洗后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑胶进行蛋白电泳，使用ＭＢＰ抗体进行蛋白质印迹以检测相关蛋白质，用考马斯蓝染色逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶检测各蛋白上样量。逡逑Ｆｉｇ．３．４邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｏｂａｃｃｏ邋ｗｈｉｃｈ邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ邋ａｓｓａｙｓ．邋ＧＳＴ邋ｏｒ逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｐｕｌｌ邋ｄｏｗｎ邋ＭＢＰ邋ｏｒ

【参考文献】