蓝狐精液冷冻及冷冻前后精子超微结构变化

发布时间：2020-07-07 22:59

【摘要】：引进芬兰优质种蓝狐,通过使用人工授精技术扩繁及改良,使我国蓝狐养殖业近20多年来得到了快速发展。目前,蓝狐使用鲜精输精受孕率超过80%。但由于缺乏相应的育种手段,种质呈现逐年退化趋势,不得不重复引进。精液冷冻技术理论上可以无限期的保存蓝狐精液,实现精液远距离的交流,同时对于生产蓝霜狐(银狐♂×蓝狐♀)具有巨大的应用意义。然而,目前蓝狐精液冷冻技术在世界范围内尚未成熟,因精子冻融后存活率低下,显著影响母狐的受孕率。为进一步了解超低温冷冻对蓝狐精子运动性及内部结构造成的损伤,从而选择更优质的冷冻保护剂和完整的蓝狐精液冷冻工艺系统,进行了本试验研究。试验(一):试验共分4组,法国卡苏精液冷冻稀释液(Ⅰ)、东林Ⅱ号—卵黄冷冻稀释液(Ⅱ)、Tris—卵黄冷冻稀释液(Ⅲ)及对照组常温稀释液东林Ⅱ号(Ⅳ)。冻融后检测三种冷冻稀释液冷冻效果,分别使用伊红—苯胺黑染色法、低渗肿胀法、考马斯亮蓝染色法检测精子存活率、精子质膜完整率、精子顶体完整率,同时检测37℃精子的存活时间及生存指数并通过与鲜精对比综合选定最佳的冷冻稀释液;试验(二):将原精分为A、B两组,A组常温稀释,B组选用Ⅲ稀释液分3批分别为B1、B2、B3组对蓝狐精液冷冻,通过IVOS精子运动检测系统检测4组精子运动情况,并通过透射电子显微镜观察A、B,两组精子内部结构;试验(三):选取解冻后精子活率高于0.3的精液对15只母蓝狐进行输精试验。结果显示:超低温冷冻对蓝狐精子的损伤很大,与Ⅳ组相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组精子冻融后存活率平均下降48.3%,精子质膜完整率平均下降48%,顶体完整率平均下降37.4%;37℃时的冻融后精子平均存活时间(13h)及平均生存指数(2.25)远低于Ⅳ组的存活时间(37h)和生存指数(7.85),精子在解冻后由于复苏温度高激发精子运动,但精子存活时间较短;在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中,Ⅲ组精子存活率、质膜完整率、顶体完整率均高于Ⅰ、Ⅱ组;三种蓝狐精液冷冻稀释液对蓝狐精子保护的效果依次为:ⅢⅠⅡ;A、B组精子运动性差异极显著(P0.01),B组快速运动的精子平均占25.1%,中速运动的精子平均占39.8%,慢速运动的精子占平均4.2%,不运动的精子平均占30.9%;B1、B2、B3组精子存活率及快速运动的精子差异显著(P0.05)。冷冻工艺存在人工操作因素影响,建议使用自动冷冻机冷冻;使用透射电子显微镜观察,B:组损伤最严重的是精子头部膜结构,顶体完整率仅占25%,冷冻对精子赤道段、颈部、尾部、线粒体及微管损伤较小;虽然蓝狐精液冻融后精子活力达0.3以上,符合常规冻精输精标准,但由于蓝狐精子冻融后在37℃条件下精子存活时间及生存指数过低,导致试验15只蓝狐只有1只产崽,冻精输精受孕率只有6.7%。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S865.23
【图文】：

损伤模式,精子,冰晶

受地域和时间限制，加快动物品种育成和改良。逡逑精子在超低温下，其代谢几乎停滞，当温度回升复苏后恢复活力且具有受精能力。逡逑但在此过程中会有大量的精子受到损伤而失去活力。冷冻对精子损伤如图１－１所示。造逡逑成精子损伤失活主要有两个理论［１８１。①冰晶机械损伤理论：精液在温度急剧下降时由液逡逑态变成固态，水分子在降温过程中形成冰晶，体积不断增大并移动，对精子产生机械压逡逑力，破坏精子细胞膜和细胞器，使得细胞膜失去保护作用，破坏线粒体使精子失去运动逡逑能力。结晶越大对精子的危害越大。冰晶形成的过程主要是因为冷冻速率过慢，冰晶主逡逑要在０？一６０°Ｃ形成，该温度被称为精子死亡温度，在冷冻过程中应迅速度过这一温度逡逑区域，冷冻速率的快慢对冰晶的产生有着很大的影响［１９］（如图１－２所示）②渗透压理逡逑论：在冷冻过程中精子细胞膜外的水分首先结晶，致使精子细胞外液的渗透压增大，使逡逑得局部渗透压增高，精子内部的水分会向外渗出造成精子脱水，细胞内浓度增加酸碱失逡逑衡

低渗溶液,精子

取１１邋ｍＬＡ、Ｂ，Ａ１邋ｍＬＩＩ，照；Ｂ组精液１０邋ｍＬ装于大ＥＰ管中，加入ｐＨ值为７．邋２的ＰＢＳ洗涤，缓慢混折均匀，逡逑４０００邋ｒｐｍ／ｍｉｎ离心３邋ｍｉｎ，弃上清液，重复洗漆３次。使用Ｔｒｉｓ—卵黄稀释液１：４等温逡逑稀释，使用注射器轻轻吹打，使得精子均匀的分布在稀释液中，分三批进行精液冷冻，逡逑分别编号为Ｂｉ、Ｂ２、Ｂ３。逡逑２．２．３精液质量检测逡逑２．２．３．１精子活率检测逡逑将染色液伊红（５％）、苯胺黑（１％）按１邋：邋１混合，３７邋°Ｃ预热。取少量稀释后的精子与逡逑染色液迅速混合，制成抹片自然干燥，显微镜下观察，死精子为红色，活精子不着色或只逡逑在头部的核环处呈淡红色。随机观察２００个精子并计算出死活精子的比例［５５］。逡逑２．２．３．２质膜完整性检测逡逑取ｌｍＬ低渗液于ＥＰ管中，３７°Ｃ预热３ｍｉｎ，取第一组精液Ｏ．ｌｍＬ加入预热的低渗逡逑液中，３７°Ｃ水浴存放３０ｍｉｎ。在高倍镜下计数２００个精子，计算出精子膨胀率。蓝狐精逡逑子在低渗溶液中，尾部出现不同程度的膨胀、弯曲。尾部膜不完整精子不会膨胀。尾部逡逑膜较完整才会出现膨胀，其中尾部膜很完整会出现完全膨胀。（如图２－１所示）逡逑

结构图,结构图,细管,精子质量

Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｄｅｔｅｃｔｏｒ逦Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｕｓｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｄｅｔｅｃｔｏｒ逡逑＿２＿７＿２人工授精逡逑将冷冻细管取出直接投入３７邋°Ｃ的温水中并不断晃动细管，持续６０邋ｓ。取出细管用逡逑巾纸将细管表面的水擦干，剪开细管两端倒入１．５邋ｍＬ无菌ＥＰ管中，３７邋°Ｃ水浴继续逡逑苏５邋ｍｉｎ，后进行精子质量检测，精子活力达到０．３以上，采用子宫内输精（１次／ｄ逡逑３邋ｄ），输精量１邋ｍＬ，有效精子数会２０Ｘ邋１０６以上。逡逑

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