中国野生毛葡萄芪合成酶基因表达与抗病功能分析

发布时间：2020-07-10 20:16

【摘要】：葡萄是世界重要的栽培果树之一,欧洲葡萄品种是主栽品种。葡萄白粉病是严重危害葡萄生产的主要真菌病害之一,病害的流行往往会带来巨大的经济损失。利用葡萄抗病种质资源培育抗白粉病新品种是提高欧洲葡萄品种抗病性的有效方法。项目组前期的研究表明中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中白藜芦醇含量高,对白粉病具有较高的抗性,挖掘其抗病基因对提高欧洲葡萄抗病性与品质具有十分重要的意义。本研究从‘丹凤-2’葡萄中克隆得到VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因序列,利用农杆菌介导法转入抗病性弱的欧洲葡萄无核白中,进行抗白粉病功能分析。主要得到的结果如下:1.中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25受生物与非生物胁迫诱导表达,并响应白粉菌及非生物胁迫诱导与刺激,表达上调。这3个芪合成酶基因在接种白粉菌后12 h表达量显著上升,分别达到了为对照的38.2倍、54.15倍和103.4倍,其次在96 h至120 h表达量较高。在其他生物小分子化合物MeJA、SA、ABA和非生物类因子创伤、低温、盐、干旱胁迫处理下表达上调,其中VqSTS12基因和VqSTS24基因对低温处理最敏感;VqSTS25基因对创伤处理最敏感。2.利用同源序列克隆技术获得编码区序列长度均为1179 bp的VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因,编码392个氨基酸,均定位于16号染色体。序列分析发现在欧洲葡萄‘PN40024’中的同源基因分别为VvSTS31、VvSTS43和VvSTS39。亚细胞定位结果表明这3个芪合成酶定位在细胞质中。利用农杆菌介导法转入欧洲葡萄无核白愈伤组织,共得到304个转VqSTS12基因无核白抗性苗,275个转VqSTS24基因无核白抗性苗,224个转VqSTS25基因无核白抗性苗。经PCR及Western blot检测最终得到7个转VqSTS12基因无核白植株,阳性率为2.30%;5个转VqSTS25基因无核白植株,阳性率为2.23%;转VqSTS24基因无核白抗性苗在Western blot检测中未检测到明显条带。3.转基因植株实时定量PCR分析与高效液相色谱(HPLC)检测,发现与野生型植株相比转基因植株中芪合成酶(STS)基因与下游白藜芦醇糖基转移酶(RSGT)基因的表达升高,STS的底物竞争酶查尔酮合成酶(CHS)基因表达降低。STS基因的表达产物中芪类物质主要是反式云杉新苷含量显著增加,其中VqSTS12过表达的OE-L7植株糖苷含量最高(135.19μg?g~(-1) Dw),是野生型植株的14.84倍。表明转基因植株中过量表达的VqSTS12和VqSTS25基因参与了白藜芦醇的合成。4.接种白粉菌后比较无核白葡萄转基因植株和野生型植株对白粉菌的抗性。表型观察发现转基因植株对白粉菌的敏感性降低,菌丝发育迟缓,部分孢子萌发受抑制。转基因植株中VqSTS12和VqSTS25基因受白粉菌诱导表达显著增加,接菌后1~3 d表达量上升,是野生型植株的83~112倍,接种第6~7 d表达量再次上升。同时检测到其表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量显著增加。较野生型植株发病较晚,病情较轻。表明转基因植株较野生型植株抗白粉病。5.干旱胁迫处理下转基因无核白植株中芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25受干旱胁迫诱导表达增加,丙二醛含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性等生理指标均优于野生型无核白植株,表现出了一定的抗干旱能力。上述研究发现,转VqSTS12和VqSTS25基因无核白植株中芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25不仅对非生物胁迫处理后表达,而且对接种白粉菌的表达也是增强的。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25可以作为改良欧洲葡萄品种的抗性基因,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’是抗病育种的种质资源。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.631
【图文】：

毛葡萄,合成酶基因,基因

第三章结果与分析第三章结果与分析3.1 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 白粉菌诱导条件下表达分析为了分析中国野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在葡萄粉菌诱导条件下的表达模式，对毛葡萄‘丹凤-2’叶片进行接种白粉菌处理。实时定PCR 结果表明 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 基因均受白粉菌诱导表达（图 3-1）VqSTS12 基因在处理后 12 h 表达量显著上升，为对照的 38.2 倍，随后表达量下降，处理后 96 h 至 120 h 表达量又回到一个较高的水平。VqSTS24 基因和 VqSTS25 基因应白粉菌诱导表达模式与 VqSTS12 基因类似，但表达强度不同。VqSTS24 基因在处后 12 h 表达量为对照的 54.15 倍，VqSTS25 基因在处理后 12 h 表达量为对照的 103倍。在自然状态下，这三个芪合成酶基因的表达水平波动较小。

毛葡萄,生物小分子,合成酶基因,胁迫诱导

西北农林科技大学硕士学位论文3.2 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 生物胁迫条件下表达分析为了分析中国野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在生物胁迫条件下的表达模式，对毛葡萄‘丹凤-2’叶片进行外源生物小分子化合物诱导处理，包括茉莉酮酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和乙烯利（Eth）。实时定量 PCR 结果表明 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 基因均受 MeJA、SA 和 ABA 诱导表达，不响应 Eth 的诱导（图 3-2）。VqSTS12 基因对 ABA 和 MeJA 处理敏感，其中 ABA处理后 3 h 表达显著上升，达到对照的 8.27 倍；MeJA 处理后 24 h 达到高峰，为对照的 6.9 倍。VqSTS24 基因响应 ABA 和 SA 诱导，其表达水平呈现先上升后下降再上升的趋势，其中 SA 处理后表达强度与响应速度高于 ABA 处理；VqSTS25 基因对 ABA 处理最敏感，处理后 3 ~ 48 h 是高表达时期。

毛葡萄,合成酶基因,创伤

qRT-PCR analysis of the expression of STS genes under 100 μM MeJA(A), 100 μM SA(B), 100 μMABA(C) and 100 μM Ethylene (D). Samples were collected at 0, 0.5, 3, 6, 12, 24 and 48 h（*P ＜0.05,**P ＜0.01）.3.3 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 非生物胁迫条件下表达分析为了分析中国野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在非生物胁迫条件下的表达模式，对毛葡萄‘丹凤-2’叶片进行创伤、低温、盐和干旱共 4 个处理。实时定量 PCR 结果表明这 3 个芪合成酶基因高度受非生物胁迫诱导表达（图 3-3）。VqSTS12 基因受所有处理诱导表达上升，处理后 0.5 ~ 24h 为高表达时期，在低温处理后 48 h 达到最高值，为对照的 22 倍。VqSTS24 基因对创伤、低温和干旱处理敏感，尤其是低温处理 24h 时，表达量达到了最高值，为对照的 41 倍。VqSTS25 基因对创伤处理最敏感，处理后 6 h 表达量最高，达到对照的 27 倍；在低温、盐及干旱诱导处理 6h后表现出高表达趋势。

【相似文献】