常见药用植物病毒病病原鉴定及基因组克隆

发布时间：2020-07-13 10:45

【摘要】：近年来药用植物病毒病发生逐年加重,寄生性强、致病力大、传染性高,已经成为影响药用植物生长的主要限制因子之一。但是药用植物病毒病的研究还很不完善,发生情况不详,病原不明,难以指导生产实践。本研究旨在对常见药用植物病毒病发生情况做初步调查和病原鉴定,为药用植物病毒病的防治和进一步研究奠定基础。采用RT-PCR方法结合生物学检测和一代测序技术,研究了人参、西洋参、罗汉果、菊花、白术、太子参、宁夏枸杞、薄荷、曼陀罗和牛蒡10种药用植物的病毒病发生情况和病毒侵染情况。在地黄、罗汉果、菊花、太子参、薄荷和曼陀罗上检测到病毒侵染,并将病原病毒鉴定到了种或属。另外,在检测基础上构建完善了针对药用植物病毒病的RT-PCR检测体系,为后续大范围开展药用植物病毒病调查提供了技术支持。高通量测序发现,表现矮化症状的菊花样品中含有与Carlavirus属病毒相似度较高的病毒。借助RT-PCR和RACE技术,克隆了目的病毒的全基因组序列,确定其为Carlavirus属的一种新病毒,命名为菊花R病毒(Chrysanthemum virus R,CVR)。CVR的基因组全长为8,874nt(不包括poly(A)尾),编码6个开放阅读框。田间调查数据表明,菊花栽培过程中接近半数的样品被CVR侵染,其为害情况高于菊花常见病毒CVB。田间调查时发现有表现病毒花叶症状的菘蓝植株,用RT-PCR方法检测到其被黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)侵染。通过对CMV菘蓝分离物CP基因序列的扩增和特征分析,明确了其属于CMVⅠ亚组。这是首次用分子生物学方法确定CMV可以侵染菘蓝,对菘蓝花叶病综合有效的防控具有重要意义。2016年秋季和2017年春季分别采集毛花洋地黄样品,经生物学检测和RT-PCR分子生物学检测,秋季样品被CMV和甜菜西部黄化病毒(Beet Western Yellow Virus,BWYV)复合侵染,春季样品被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV2)和油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)复合侵染。设计特异引物进行RT-PCR克隆了 BWYV-毛花洋地黄分离物、BBWV2-毛花洋地黄分离物和YoMV-毛花洋地黄分离物的部分序列信息。这是首次用生物学和分子生物学方法,在毛花洋地黄病毒病样品上分别检测到了 CMV和BWYV及BBWV2和YoMV的复合侵染。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.67
【图文】：

病毒病,菊花,症状,矮化

３．２．１．１检测样品逡逑２０１７年２月北京市植保站提供的４份菊花样品，分别编号为ＪＨ－１？４，均表现逡逑矮化症状，ＪＨ－３同时表现矮化和黄化症状（图３－１）。逡逑漏＿逡逑ＪＨ－１逦ＪＨ－２逡逑ｍｍ逡逑ＪＨ邋－３逦ＪＨ－４逡逑图３－１菊花病毒病症状图逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ邋ｖｉｒｕｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ逡逑

电泳图,菊花,电泳图,样品

ＲＴ－ＰＣＲ邋检测病毒：ＣＭＶ、Ｐｏｚｙｗ－ｍｓ１、ＣＳＶｄ邋和邋ＣＶＢ。逡逑ＲＴ－ＰＣＲ检测：采用ＴＲＮｚｏｌ法（具体方法参照第二章）分别提取菊花样品叶片逡逑总ＲＮＡ，对样品的总ＲＮＡ电泳，从电泳图（图３－２）中可观察到ｒＲＮＡ条带，表明逡逑４个样品的总ＲＮＡ提取成功。逡逑１逦２逦３逦４邋Ｍ逡逑注：２，０００邋ＲＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？４：菊花样品邋１邋？４逡逑图３－２菊花样品总ＲＮＡ电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，ＣＶＢ的特异检测引物ＣＶＢ－Ｕ／ＣＶＢ－Ｌ在ＪＨ－４样品中扩增逡逑到与阳性对照大小一致的条带，ＣＳＶｄ特异检测引物ＣＳＶｄ－２０８Ｆ／ＣＳＶｄ－２０７Ｒ在ＪＨ－逡逑１和ＪＨ－３样品中扩增到与阳性对照大小一致的条带（图３－３）。逡逑逦ＣＶＢ逦邋逦ＣＶＳｄ逦逡逑１２３４５６７８９逦１０邋Ｍ逡逑７５０邋ｂｐ逡逑丨、＇逦Ｂ＾－５００邋ｂｐ逡逑■？—２５０邋ｂｐ逡逑注：Ｍ：邋２，０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；邋１、６：邋ＪＨ－１；邋２、７：邋ＪＨ－２；邋３、８：邋ＪＨ－３；邋４、９：邋ＪＨ＿４；邋５、１０：阴逡逑性对照；逡逑

电泳图,病毒病,罗汉果,症状

【参考文献】