大麦黄花叶病相关的NAC转录因子克隆与功能研究

发布时间：2020-07-20 18:44

【摘要】：大麦是世界上重要的禾谷类作物,种植面积广,在我国也有悠久的栽种历史,其主要用作牲畜饲料、食品加工原料以及酿造啤酒等。大麦黄花叶病是土传病毒,病毒寄生于土壤中禾谷多黏菌的孢子中,具有发病范围广,传播速度快,感染率高的特点,对冬大麦品种造成产量损失甚至达到半数以上。转录因子在植物抵抗外界胁迫中起着重要的作用。本课题对大麦中的NAC转录因子进行研究,寻找与大麦黄花叶病相关的NAC基因,并对其功能进行研究。本实验研究对象采用大麦黄花叶病易感品种Morex,Igri以及Barke,通过转录组测序鉴定感染大麦黄花叶病致病相关基因的调控网络;通过通路克隆的技术得到与大麦黄花叶病相关的两个NAC转录因子,对其进行生物信息学分析预测该基因的表达特征和与其他物种的进化关系;构建载体后进行由农杆菌介导的亚细胞定位;采用酵母双杂技术研究转录因子互作的蛋白。了解大麦感染BaMMV中两个NAC转录因子HvNAC6(HORVU5Hr1G011650)和HvNAC7(HORVU7Hr1G106480)的作用,为后期培育抗大麦黄花叶病品种提供基础。1.参考依据RNA-seq分析的结果,在本转录本共37,804个基因中,在用大麦黄花叶病感染Igri幼苗前后,有效差异表达的基因数为10,164个,其中上调表达的基因数为5,192个,下调表达的基因数为4,972个。其中预测得到了534个转录因子,分属与多个不同的转录因子家族。2.大麦感染BaMMV前后进行RNA-seq分析后,HvNAC6和HvNAC7有明显表达的上调。通过组织表达分析发现,HvNAC6多在结实后期以及外颖壳中都有显著表达,但是在幼嫩的新生穗中没有表达,新生穗中有微弱的表达。HvNAC7在苗根中有显著的表达。由保守结构域分析,两个NAC转录因子都具有NAC家族保守结构域。3.由农杆菌GV3101介导感染烟草对HvNAC6和HvNAC7进行亚细胞定位,结果显示两者都是核定位蛋白,在细胞核中的行使相应的功能。4.转录因子在酵母系统中与BaMMV病毒蛋白构建、易感因子eIF4E、隐性抗病基因PDIL5-1进行酵母双杂交,结果没发现有蛋白互作。这表明其并没有直接作用于感染BaMMV的过程中,可能多作为一个调控或者是修饰的转录因子的存在于这个过程中。5.通过qRT-pcr技术分析HvNAC6和HvNAC7在在抗感材料中的表达差异。只发现HvNAC7在24份大麦黄花叶病感病材料中的表达水平显著高于24份抗病材料中表达水平,表明HvNAC7与大麦黄花叶病感染的响应调控有着重要的关系。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.123
【图文】：

毒粒子也能够获得足够的蛋白，这使得病毒在土壤中能够存活许时间通常发生在秋季，而叶片上的病理症状的出现通常是在冬季病植株的主要表现症状是叶片出现浅绿色和黄色的色素沉着同时大麦被病毒侵染后，其植株分蘖数降低，出现矮小发育不良的症和粒重也严重降低[20,21]。大麦黄花叶病的发病程度还受到轮作的种类与数量、外界环境的气温以及空气湿度等因素的影响。在植，老叶以及嫩叶的上端部分不容易出现病症，这个现象可能与植有着密切关系[22]。在新叶出现病斑之前，使用 RT-PCR/ELISA 技对低的接种的部位及根细胞和新叶新生部位检测到病毒的。随着病毒侵入大麦叶绿体后不断复制，导致叶绿体胀肿裂解，光合作用，继而发生病害[24]。然而，大麦黄花叶病在植株体内的待研究。

基因座,耐受性,抗性,位置

8图 1-2 已定位对 BaYMV 和 BaMMV 有抗性/耐受性的基因座的遗传位置Fig. 1-2 Genetic position of mapped loci conferring resistance / tolerance to BaYMV and BaMMV.The diagram was integrated and modified from Ordon et al. (2005) and Hiroomi et al. (2011)1.2.5 大麦黄花叶病的抗病育种大麦黄花叶病是通过土壤中的禾谷多黏菌为媒介进行传播的，土壤中的禾谷多黏菌数目多并且其休眠孢子具有很强的生存能力，禾谷多黏菌寄生于土壤和植物根系中，所以采用农药等化学方法很难对病害起到有效的防治。因此，唯一可持续的保护大麦作物的有效途径就是提高大麦品种自身对大麦黄花叶病的抵抗力，通过对现有的大麦种质资源的系统检测以鉴定出对病害表现抗性的基因型并选育和推广对大麦黄

示意图,基因结构,示意图,亚结构

activation regions，TARs）且保守性很低。Ooka 等[67]对拟南芥和水稻测序预测分析，将 NAC 蛋白可分为两大类（Group I 和 Group II）和 18 亚类。NAC 转录因子 N 端的结构域含有约 130~150 个氨基酸，可分为 A-E5 个亚结构域，其中 A 可能与二聚体形成有关，C 和 D 可以识别特定启动子以结合 DNA，同时 D 亚结构还含有一个疏水性的负调节区有抑制转录活性的功能。A、C、D 亚结构非常保守，而 B 和 E 亚结构的结构就相对多变保守性较低，这使得转录因子的功能具有多样性。而在低保守性的 C端，通常由简单的重复序列组成，比如 Thr-Ser，Pro-Glu。NAC 蛋白的寡聚化位点位于 NAC 结构域，而蛋白 C 端序列会影响 NAC 成员之间的寡聚化作用[69]。随着科学技术的创新和发展，发现鉴定了越来越多的 NAC 转录因子。NAC 基因家族成员很多，到目前为止，在水稻中发现 149 个 NAC 成员，大豆中有 101 个，拟南芥中发现 106个，烟草中含有 152 个 NAC 成员。

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