螺虫乙酯在家蚕体内的代谢研究

发布时间：2020-07-22 04:09

【摘要】：螺虫乙酯(Spirotetramat)是一种能有效防治蚜虫、蓟马、粉虱等刺吸式口器害虫的杀虫剂。目前,国内外关于螺虫乙酯的研究,主要集中在合成工艺、药效、在植物体内的消解残留及在环境中的迁移转化方面。有研究发现螺虫乙酯对害虫的田间药效已有所下降,昆虫害虫会发生代谢或其他原因导致对螺虫乙酯产生抗药性,目前尚无螺虫乙酯在昆虫及哺乳动物体内的代谢研究以报道。为了研究螺虫乙酯在家蚕体内的代谢规律,本论文以螺虫乙酯为研究对象,以家蚕为材料,建立了螺虫乙酯及4种代谢物在家蚕主要组织部位中的残留分析方法;研究了螺虫乙酯对家蚕的毒性及其在家蚕中肠、丝腺、脂肪、血液、粪便中螺虫乙酯及代谢物的分布;分析了螺虫乙酯对家蚕3大解毒酶系的活性变化影响;通过qRT-PCR技术分析了螺虫乙酯对家蚕解毒酶相关基因表达的影响。主要研究结果如下:(1)采用QuEChERS样品前处理方法,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测技术,以负离子扫描和多反应检测模式(MRM),建立了家蚕中肠、丝腺、脂肪中螺虫乙酯及代谢物的残留分析方法。结果表明,以甲醇为提取溶剂,经C18净化,螺虫乙酯及代谢物的添加回收率为80.2-108.7%,满足农药残留检测要求,适合家蚕各组织部位样品中残留螺虫乙酯及代谢物的多残留检测。(2)分析了各组织部位中螺虫乙酯及2种代谢物的分布及随时间的变化情况。结果表明,B-enol及B-keto能在家蚕所有组织中检测到;B-glu仅在中肠及粪便中被检测到;B-mono无法检测到。从变化趋势看,螺虫乙酯能在中肠中降解为B-enol、B-keto及B-glu,且B-glu能通过粪便快速排出体外。经过血液的流动,螺虫乙酯及B-enol能在丝腺中积累,含量升高,且不易被降解转移,而在脂肪中,B-enol含量不断增高,说明螺虫乙酯在脂肪内被有效降解为B-enol,B-keto在中肠、丝腺、脂肪中都呈下降趋势,说明螺虫乙酯被快速降解为B-keto,随后B-keto慢慢被转移并排出。(3)螺虫乙酯暴露后,测定家蚕各组织部位(中肠、血液、丝腺和脂肪)3种解毒酶的活性变化。研究发现,在中肠中,处理组3种酶活性均高于对照组,中肠是家蚕的主要消化器官,螺虫乙酯在中肠中能被快速代谢,并被快速排出体外,说明中肠可能是代谢螺虫乙酯的主要场所,且3种酶均有参与螺虫乙酯的代谢。在丝腺中,仅GST活性有所上升,螺虫乙酯能够在丝腺中少量代谢,但大量的螺虫乙酯及代谢物在丝腺中积累。在脂肪中,P450活性较高,为对照组的1.87-2.44倍,螺虫乙酯在脂肪中大多能被代谢,但B-enol持续升高,说明P450可能参与螺虫乙酯的代谢,但脂肪不能将B-enol代谢并排出体外。在血液中,仅GST活性上升,说明血液对有毒物质较小的代谢作用可能与GST有关。(4)以解毒酶 7 个相关基因CYP9a19 CYP9a22、CYP6AB4、GST01、GSTe2、Bm CarE-11和BmCarE8-V1为研究对象,研究螺虫乙酯处理后家蚕解毒基因的表达情况。结果表明在中肠中,P450 3种基因的上调说明P450参与了家蚕对螺虫乙酯的代谢过程。GST相关基因上调水平较低,最高上调了 1.7-1.8倍。说明GST不是中肠主要的解毒酶。相比中肠中7种基因较高的表达量,脂肪中基因表达量较低,且随时间无显著变化趋势,这可能是由于螺虫乙酯对于脂肪合成的抑制作用,影响了解毒酶基因的表达,从而调控解毒酶活性。通过螺虫乙酯在家蚕体内的代谢研究,以明确其在家蚕体内的代谢产物;了解家蚕的主要代谢途径;阐明解毒酶的作用及相关基因的调控作用。因此,此研究为螺虫乙酯的合理使用和安全性评价提供了理论依据。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S482.3
【图文】：

技术路线图,乙酯,解毒酶,扬州大学

图１．３技术路线图逡逑

乙酯,代谢物,提取溶剂,中肠

图２．１提取溶剂对螺虫乙酯及代谢物添加回收率的影响逡逑（ａ：脂肪，ｂ：中肠，ｃ：丝腺，ｄ：血液，ｅ：粪便）逡逑２．２．２净化方法的选择逡逑采用甲醇溶液能有效的提取螺虫乙酯及代谢物，但是生物样品提取液仍含有较多内源逡逑性干扰物，如蛋白质、脂肪等，本研究应用改良的ＱｕＥＣｈＥＲＳ方法，以甲醇为提取溶剂，逡逑考察了邋ＧＣＢ、Ｃ１８及其等质量混合物共３种吸附剂及用量（２４、４８、９６ｍｇ）对家蚕样品的逡逑净化效果及对添加回收率的影响。结果表明，对于家蚕中肠样品的净化，ＧＣＢ、Ｃ１８均能有逡逑效吸附色素等杂质。ＧＣＢ吸附杂质效果更为明显，但对Ｂ－ｋｅｔｏ、Ｂ－ｅｎｄ的回收率影响较大。逡逑以Ｃ１８为吸附剂，螺虫乙酯及代谢物在中肠样品中的添加回收率的范围为７９．６－１０９．３％，且逡逑随着添加量的增多，样品中杂质去除率增高，但回收率降低。当吸附剂为ＧＣＢ、Ｃｌ８等质逡逑量混合物时，能有效吸附杂质，对螺虫乙酯及代谢物回收率影响较小，但在４８、％邋ｍｇ添逡逑加量下对Ｂ－ｋｅｔｏ的回收率有较大影响，回收率分别为７１．２％和６９．９％。逡逑

乙酯,食桑量,家蚕,粪便

暴露于螺虫乙酯２４邋ｈ后，５龄幼虫未表现出明显的中毒症状，但７２邋ｈ后高浓度（５００逡逑ｍｇ／Ｌ）处理的家蚕表现出食桑量减少，发育不良的症状，死亡率为１９．８％，低浓度（５０邋ｍｇ／Ｌ）逡逑处理的家蚕未表现出明显的食桑量减少情况（图３．１－３．２）。本试验的供试浓度为２００ｍｇ／Ｌ，逡逑低于其ＬＣ５0值。逡逑＊２－１逦５００邋ｍｇＬ逦－？－ＣＫ逦２．０邋ｎ逦ｍ邋ｍｇ／Ｉ邋－Ａ－５０逡逑Ｉ＇＇２＂逡逑ｉ邋Ｔ逦ｉ０－８－邋ｋ；逡逑１邋°．４－逡逑４邋￣邋１逦邋ｉ逦！逦１逦－邋ｉ逦逦Ｉ邋＇逦Ｉ逡逑０逦２４逦４８逦７２逦２４逦４８逦７２逡逑时间（ｈ）逦时间（ｈ＞逡逑图３．１螺虫乙酯对家蚕生长的影响逦图３．２螺虫乙酯对家蚕食叶量的影响逡逑２．２螺虫乙酯在家蚕主要器官中的分布及代谢逡逑家蚕在给药后２４ｈ内，螺虫乙酯在中肠、脂肪体、丝腺、血液及粪便中均有发现，螺逡逑虫乙酯主要代谢物Ｂ－ｋｅｔｏ、Ｂ－ｅｎｏｌ在各组织部位及粪便中都能检测到，在中肠及粪便中能逡逑检测到微量的Ｂ－ｇｌｕ，未能检测到Ｂ－ｍｏｎｏ邋（表３．１）。由此推测螺虫乙酯在家蚕体内主要通逡逑过酯键断裂生成主要代谢物Ｂ－ｅｎｏｌ，Ｂ－ｅｎｏｌ又经过氧化反应生成代谢物Ｂ－ｋｅｔｏ，少

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