防治苦瓜枯萎病的木霉菌株分离鉴定、定殖检测及其防病促生机理

发布时间：2020-07-28 11:10

【摘要】：农业生产中化肥农药的大量使用导致环境污染、生态失衡、农产品品质下降、农残超标等问题日益严重。随着生活水平的提高,人们对绿色有机农产品越来越推崇,国家也大力提倡减肥减药以保障农产品安全,迫切需要一种安全高效的新措施来取代传统的化学防治。生物防治是以具有防病和促生作用的微生物作为生防因子来防治植物病害,近年来,以其安全高效的优势逐渐受到重视,成为替代化学防治的重要措施。木霉菌(Trichoderma spp.)是一类应用广泛、防病效果显著的生防菌。本研究从蔬菜田中采集了12份植株及根际土样品,从中分离纯化出11株木霉菌,从中筛选出两个对苦瓜枯萎病菌有较好拮抗作用的木霉菌株M2和MX,对苦瓜枯萎病的盆栽防效分别为79.27%和47.75%。通过形态学鉴定和基于ITS、tef1α、rpb2基因的分子生物学鉴定,M2菌株鉴定为绿木霉(Trichoderma virens),MX菌株鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。两株木霉生物学特性的研究结果显示,两株木霉在15-35℃均能较好地生长并产孢,温度过高或过低均会抑制其菌丝生长和产孢,两株木霉的最适生长温度和最适产孢温度相同,为25-30℃;绿木霉M2生长及产孢的最适pH为6-7,棘孢木霉MX的最适pH为5-6;绿木霉M2的最适碳源为葡萄糖、果糖和乳糖,棘孢木霉MX的最适碳源为葡萄糖、蔗糖;维生素B6对两株木霉的菌丝生长和产孢影响最大;M2菌株的最适氮源为天门冬素、牛肉浸膏和硫酸铵,MX菌株的最适氮源为硫酸铵,尿素对两株木霉的生长和产孢均有抑制作用;光照条件仅对两株木霉的产孢有较大影响,持续光照情况下最有利于产孢。两株木霉均有广谱的抑菌活性。在与不同的病原菌的平板对峙试验中,两株木霉对苹果树腐烂病菌、番茄灰霉病菌抑制效果最好,对玉米纹枯病菌、杨树水泡溃疡病菌、苹果霉心病菌、核桃炭疽病菌、黄瓜褐斑病菌和小麦赤霉病菌的抑制效果次之,对甘薯根腐病菌抑制效果较差。应用实时荧光定量PCR技术对两株木霉49 d周期内在植物组织及土壤中的定殖能力进行了检测,结果显示:两株木霉在苦瓜植株的根茎叶组织中定殖能力均较差,但在土壤中可以快速稳定地定殖。本研究测定了施加两种木霉菌剂的苦瓜植株体内三种防御酶(PPO、POD、PAL)活性及根系活力的影响,结果显示,施加了木霉菌剂可以有效地提高植物体内防御酶的活性或延缓其下降趋势,达到保护植株抵抗病原菌侵染的目的。本研究对两株木霉挥发性、非挥发性次生代谢产物的拮抗活性进行了试验,结果显示,两株木霉非挥发性次生代谢产物对苦瓜枯萎病菌均有较强的抑制作用,挥发性次生代谢产物的抑制作用不显著。两株木霉对苦瓜植株还具有一定的促生作用,具体表现在可以促进植物新根的产生及毛细根的发育,提高植物鲜重、干重、株高、茎粗等生长指标。定量地测定了两株木霉对难溶性磷酸盐和钾的解磷解钾能力,结果表明其解磷能力较好,可以促进植物对土壤中养分的吸收。通过对两株木霉在植物防病促生方面的作用机理进行初步探究,可以看出,绿木霉M2和棘孢木霉MX菌株是两个防病效果较好、兼具一定促生作用的生防菌株,具有良好的开发应用前景。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476;S436.429
【图文】：

形态图,绿木霉,分生孢子梗,形态

防治苦瓜枯萎病的木霉菌株分离鉴定、定殖检测及其防病促生机定结果 PDA 培养基上生长较快，72 h 可长满整个平板的同心轮纹，在 CMD 培养基上气生菌丝稀疏，SNA 培养基上气生菌丝极稀疏，仅可见墨绿至浅分枝不规则，每个分枝最顶端有 3-6 个紧密贴在分枝，分枝直角出或向顶呈反射状；瓶梗为坛形顶变细，顶端着生分生孢子；分生孢子阔椭圆形图 1、3）。

形态图,木霉,分生孢子梗,形态

图 2 棘孢木霉 MX 的分生孢子梗形态Fig.2 Conidium morphology of Trichoderma asperellum MX图 3 木霉 M2、MX 菌株在不同培养基上生长形态

形态图,木霉,菌株,形态

25图 3 木霉 M2、MX 菌株在不同培养基上生长形态Fig. 3 growth morphology of Trichoderma M2 and MX on different media2.2 分子生物学鉴定结果用三对通用引物分别扩增出两株木霉的 ITS、tef1、rpb2 基因序列，菌株长度分别为 577 bp、581 bp、954 bp，菌株 MX 的三段序列长度分别为 51294 bp。将两株木霉的序列分别与下载的木霉菌株序列进行同源性比较，并构建联合系统发育树。建树所用菌株信息见表 3。

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