枣缩果病互隔链格孢菌侵染特性及抗药性研究

发布时间：2020-07-30 05:08

【摘要】：枣缩果病是一种在枣生产上造成重大经济损失的病害,为了找到合适的防治方案,本研究对枣缩果病初侵染互隔链格孢菌(Alternaria alternata)的侵染特性和抗药性进行了研究。采用农杆菌转化法对CN193菌株进行gfp标记,采用花期喷雾接种法和幼果期接种法用CN193::gfp对枣树进行侵染,并用CN193::gfp对可能的潜在寄主植物进行致病力测定,确定潜在寄主,在此基础上筛选适合枣缩果病初侵染互隔链格孢菌(A.alternata)研究的替代寄主,最后以CN191、CN192、CN193和CN194菌株为研究对象检测互隔链格孢菌(A.alternata)对异菌脲和苯甲丙环唑抗药性。主要结果如下:采用农杆菌转换的方法将含有gfp基因的质粒导入CN193中,并得到成功表达gfp的CN193菌株,且标记菌株在经过5次传代培养后,仍具有良好的发光表型,能稳定表达gfp蛋白,并且标记菌株CN193::gfp对枣果保持了原有的致病力。林间采用花期喷雾法和幼果期刺伤法接种CN193::gfp,观察发病情况及症状,用潮霉素B平板分离回收接入的病原菌CN193::gfp,并检测荧光。结果表明,用潮霉素B平板分离回收,检测到CN193::gfp菌株可在花期和幼果期的伤口处侵入,且均可使花期喷雾接种、幼果期刺伤接种枝条上的枣果和其同株未接种枝条上的枣果发病。选取枣园周围栽植的番茄、烟草、苹果、梨、毛白杨和加杨,用CN193::gfp的孢子悬浮液进行刺伤和无伤接种,将发病部位病健交界处组织置于加有10μg·mL~(-1)潮霉素B的PDA培养基上培养,荧光显微镜下观察发病组织和从各寄主上分离获得的病菌菌丝。刺伤接种7 d后,除烟草外,其他刺伤的材料均发病,发病率依次为番茄果实45.8%、苹果果实79.2%、苹果叶片75.0%、梨果实56.3%、梨叶片52.1%、毛白杨叶片66.7%和加杨叶片54.2%;无伤处理的仅番茄发病,其他材料和对照组均未发病。番茄病部组织的荧光清晰可辨;在发病的番茄果实、苹果果实和叶片、梨果实和叶片、毛白杨和加杨离体叶片病部组织分离后长出的菌丝中,均可以观察到明显的荧光。枣缩果病菌能成功侵染番茄、苹果、梨、毛白杨和加杨,并可使各寄主植物产生与番茄黑斑病、苹果褐纹病、梨黑斑病和杨树叶枯病相同的症状,推断番茄、苹果、梨、毛白杨和加杨为枣缩果病菌的潜在寄主,扩大了枣缩果病菌初侵染来源的范围。采用刺伤、无伤和喷雾接种的方法在活体的番茄和烟草上接种CN193孢子悬浮液,待发病后分离各病原菌回接到枣果上检测其致病性,并用番茄黑斑病菌侵染枣果,对番茄黑斑病菌进行形态和分子鉴定。结果表明,活体番茄花期喷雾接种和幼果期刺伤接种均发病,且番茄花期接种与枣花期接种的发病症状相似;活体烟草花期和刺伤接种均未发病;将各分离物回接到枣果上,枣果均发病且发病率与对照组CN193的发病率无显著性差异;番茄黑斑病菌刺伤接种枣果发病,且症状与CN193相同;番茄黑斑病菌与CN193的菌落性状、产孢表型和形态均无差异,结合分子鉴定结果将番茄黑斑病菌鉴定为互隔链格孢菌(A.alternata),且与CN193相似性为100%。因此,番茄适合作为枣缩果病初侵染病菌的替代寄主,为快速筛选防治药剂奠定了基础。采用菌丝生长速率法测定了CN191、CN192、CN193和CN194菌株,对异菌脲和苯甲丙环唑这2种药剂的敏感性;选取对这2种药剂最为敏感的菌株进行抗药性筛选,并以筛选到的抗药菌株为试验对象测定其对另一种药剂的敏感性。2016和2017年,在林间施用过和未施用过这2种药剂的枣园用这2种药剂进行防治试验,并于发病初期和盛期调查发病率。结果表明,CN194对这2种药剂都很敏感,经诱导后得到稳定的抗异菌脲突变体CN194y,与苯甲丙环唑没有交互抗性。在施用过这2种药剂的林间,苯甲丙环唑的防治效果较好,分别为81.3%和51.3%;在未施用过这2种药剂的林间,异菌脲的防治效果较好,分别为92.9%和68.4%。不同地区枣缩果病菌对异菌脲和苯甲丙环唑的敏感性各异,但敏感趋势相同;互隔链格孢菌(A.alternata)对异菌脲易产生抗药性,对苯甲丙环唑不易产生抗药性,且2种药剂之间无交互抗性。林间防治以异菌脲和苯甲丙环唑交替施用方案为佳。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.65
【图文】：

潮霉素,继代,菌丝,荧光显微镜

菌 CN193的 gfp 标记孢菌 CN193对潮霉素 B 的敏感性 CN193 菌丝生长的毒力回归方程为 y＝1.122 4x＋7.809 5，相关mL-1，因此，CN193 对潮霉素 B 的敏感性较强，且潮霉素 B 的 CN193及其稳定性fp 接种到无潮霉素 B 的 PDA 培养基上继代培养 5 代，在荧光显见菌丝中的荧光（图 3-1A），且与继代培养 5 代前的 CN193:度无差异。将在无潮霉素 B 的 PDA 培养基中继代培养 5 代后的含有 10 μg mL-1潮霉素 B 的培养基上，菌落可以正常生长CN193::gfp 和野生型菌株 CN193 在无潮霉素 B 的培养基上培养野生型菌株 CN193 的菌落块直径分别为（5.43±0.03）和（5.50±果表明，gfp 标记的 CN193 菌株遗传转化后的特征明显且稳定。A B

枣果,潮霉素,菌落

将在无潮霉素 B 的 PDA 培养基中继代培养 5 代后的 10 μg mL-1潮霉素 B 的培养基上，菌落可以正常生长3::gfp 和野生型菌株 CN193 在无潮霉素 B 的培养基上培养菌株 CN193 的菌落块直径分别为（5.43±0.03）和（5.50±，gfp 标记的 CN193 菌株遗传转化后的特征明显且稳定。镜下观察继代 5 代后的 CN193::gfp（A）和初代的 CN193::gfp（B）e hyphae of CN193::gfp after 5 subcultures (A) and CN193::gfp with no sufluorescence microscope193的致病力A BA B

幼果期,症状,菌丝,枝条

于成熟前脱落；幼果期刺伤接种部位出现红褐色略凹陷的病斑（图3-3B），于成熟前脱落；自然发病的枣果于成熟前变红褐色皱缩（图 3-3C），且成熟前脱落。无论是花期喷雾，还是幼果期刺伤接种，它们的发病症状和病变过程都与自然发病的表现基本相似。3.2.2 不同部位的枣果中检测 CN193::gfp图 3-4 荧光显微镜下不同部位病果中分离的菌丝Fig. 3-4 Observation of the hyphae isolated from different parts of the disease fruits under fluorescence microscope注：A：花期喷雾接种枝条上的病果中的菌丝；B：花期喷雾同株未接种枝条上的病果中的菌丝；C：幼果期刺伤接种的病果中的菌丝；D：同株靠近幼果期刺伤接种枝条，但未接种枝条上的病果中的菌丝。Note: A: Hyphae from diseased fruits by inoculation of flower spraying; B: Hyphae from diseased fruits on the non-inoculated neighbouringbranches close to inoculated branches by flower spraying; C: Hyphae from diseased fruits by inoculation of needle stabbing; D: Hyphae fromdiseased fruits on the non-inoculatedneighbouringbranches close to inoculated branches by needle stabbing.5 cmA0.5cmB5cmCA B C D

【参考文献】