线虫肠道内生菌对生防细菌定植障碍的潜在机制

发布时间：2020-07-31 12:42

【摘要】：在前期的研究工作中发现杀线虫芽孢杆菌B16能够有效杀死松材线虫,是较为理想的松材线虫生防细菌,可作为松材线虫防治的生防菌进行开发使用。随着研究的深入,我们发现一些松材线虫肠道内生菌可以抑制杀线虫芽孢杆菌B16的生长繁殖,抑制杀线虫芽孢杆菌B16在线虫体内的定植。其中SCO41菌株是线虫肠道内生菌中对杀线虫芽孢杆菌B16定植作用抑制最为明显的一株,实验找出内生菌SCO41菌株对杀线虫芽孢杆菌B16定植抑制的机制,就可以通过生物学的方法和手段对杀线虫芽孢杆菌B16进行改良,或者通过改变线虫肠道内生菌的菌落平衡,来增强杀线虫芽孢杆菌B16在线虫体内的定植效果,增强其对线虫的杀灭能力,进而为以杀线虫芽孢杆菌B16为生防细菌开发新的生防菌剂提供参考依据。本研究利用多种生物学手段和方法,筛选、分离、纯化得到线虫肠道内生菌,对线虫肠道内生菌SCO41菌株进行了较为详细的研究,对其抑制杀线虫芽孢杆菌B16定植的机制进行了预测,取得了预期效果。本研究主要得到以下研究结果。(1)从松材线虫肠道内筛选、分离、纯化得到5株线虫肠道内生菌,对内生菌菌株进行了菌种保存;内生菌命名为SCO1,SCO2,SCO6,SCO9和SCO41。(2)通过内生菌活性测试实验,得出了线虫肠道内生菌与杀线虫芽孢杆菌B16的互作关系,其中内生菌SCO1,SCO6对杀线虫芽孢杆菌B16的定植生长没有抑制作用;内生菌SCO2,SCO9和SCO41能够抑制杀线虫芽孢杆菌B16在线虫体内的定植生长。其中,SCO41菌株对杀线虫芽孢杆菌B16的定植生长抑制作用最为强烈。(3)详细的研究了内生菌SCO41菌株,经分类鉴定,SCO41菌株呈杆状,无鞭毛,为革兰氏阴性细菌;菌落光滑呈圆形,透明,边缘整齐,有粘性;经实验研究和系统发育分析鉴定发现SCO41菌株属于植物病原菌属Phytobacter中的一个新种。(4)对内生菌SCO41菌株进行全基因组序列测序分析,内生菌SCO41菌株基因组测序共得到109,283个reads,基因组大小为1517Mbp,序列平均读长为13,882bp,测序序列N50长度大小为18,679bp,测序序列平均质量值为0.84。(5)对内生菌SCO41菌株的全基因组序列测序结果进行分析,基于全基因组测序分析结果,推测出了内生菌SCO41菌株抑制杀线虫芽孢杆菌B16定植的潜在机制。(1)内生菌SCO41菌株的基因组中含有大量与鞭毛有关的编码基因,但在对SCO41菌株进行形态鉴定时没有发现菌株有鞭毛结构,推测这些基因编码的蛋白与细菌的免疫有相关,菌株鞭毛基因编码产生的蛋白是抑制杀线虫芽孢杆菌B16在线虫肠道内定植的主要物质。(2)分析研究发现内生菌SCO41菌株的基因组中含有15个与肠杆菌素Enterobactin相关的编码基因,肠杆菌素Enterobactin是一种抗生素,能够作用于其他细菌,因此推测SCO41菌株的肠杆菌素Enterobactin是抑制杀线虫芽孢杆菌B16在线虫肠道内定植的主要因子。(3)在内生菌SCO41菌株的基因组注释结果中发现含有蛋白分泌系统T6SS中的HIS-I相关的编码基因11个,在注释得到的总注释结果中占有较大的比例,HIS-I的攻击对象是菌株生存环境中的其他细菌,通过对其他细菌的攻击使自身在环境中形成竞争优势,由此推测通过T6SS中的HIS-I分泌系统攻击生存环境中的其他竞争菌株是SCO41菌株抑制杀线虫芽孢杆菌B16在线虫肠道内定植的潜在机制之一。综上实验研究结果表明,线虫肠道内生菌对线虫的免疫功能有一定的作用,一些内生菌能够降低生防细菌对线虫本身的杀灭作用。内生菌SCO41菌株能够抑制杀线虫芽孢杆菌B16在松材线虫肠道内的定植,从基因水平探究SCO41菌株对杀线虫芽孢杆菌B16抑制机制,能够为以杀线虫芽孢杆菌B16为生防菌开发新的松材线虫生防菌剂提供理论支撑;也为通过其他生物学手段来改造生防细菌或改变松材线虫肠道菌落结构来增强生防菌对线虫的杀灭作用提供基础依据。本研究的创新点是从线虫肠道内生菌与线虫生防细菌的关系入手来研究,用新的思路来考虑生防细菌的定植效果和生防细菌对线虫的杀灭效果,为提升生防菌在线虫肠道内的定植效果和以杀线虫芽孢杆菌B16为生防菌来开发新的生防菌剂提供支持。
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.18
【图文】：

内生菌,互作,线虫

图 3-1 5 株内生菌与 B16 互作结果Fig 3-1 Interaction between 5 endophytes and B16注： 1：SCO1； 2：SCO2 ；3：SCO6； 4：SCO9；5：SCO41；对：LB 液体培养基Note：part 1:SCO1； part 2: SCO2；part 3: SCO6； part 4: SCO9；part 5: SCO41； part 6: LB；内线虫肠道内生菌对生防菌定植障碍测试验通过平板转移喂养法进行，实验过程中不同时间段使用荧光显微镜对，发现不同时间段，完全喂养 SCO41 菌株的线虫体内被标记过的杀线16 的含量很少，没有发现 full 类型的线虫；混合喂养了内生菌菌株 S1 菌株的线虫体内随着时间的不断增长，体内的杀线虫芽孢杆菌 B16 的，发现了 full 类型的线虫，数量少于喂养了内生菌 SCO1 菌株实验组和

菌株,内生菌,实验观察,菌落

南阳师范学院硕士学位论文.3 内生菌 SCO41 的分类鉴定.3.1 形态鉴定经过实验研究观察，发现线虫肠道内生菌 SCO41 菌株的菌落湿润，菌落小而，呈圆形，边缘较为圆滑，光泽度较高，质地较软，颜色透明，在挑取时有粘性经过革兰氏染色实验观察，发现 SCO41 菌株呈红色，属于革兰氏阴性菌。经扫描电镜实验观察，SCO41 菌株呈杆状或短杆状，长度约 1.525～2.557μm度约 0.5547μm，无鞭毛结构。

生长曲线,生长曲线,菌株,精氨酸

图 3-4 SCO41 菌株的生长曲线图Fig 3-4 Growth curve of SCO41API 20E 实验条测试结果根据 API 20E 生化反应表判定反应结果，得到 ONPG，CIT，GLU，MAN，SORRHA，SAC，AMY，ARA 等 9 个反应结果呈阳性，说明 SCO41 菌株能够利用这些底物；其他反应呈阴性，说明 SCO41 菌株不能利用这些物质。具体结果如表 3-23。表 3-2 API 20E 测试结果Tab3-2 Results of API 20E反应底物及反应酶检测结果GEL Kohn 明胶明胶酶 -ADH 精氨酸精氨酸双水解酶 -URE 尿素尿酶 -

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