家蚕二分浓核病毒结构蛋白与潜在受体蛋白的互作研究

发布时间：2020-08-01 17:31

【摘要】：家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是国际病毒分类委员会(ICTV)于2012年新设立的二分DNA病毒科中唯一的代表种。BmBDV特异性侵染家蚕中肠柱状上皮细胞,病蚕体呈现软化、中肠柱状细胞浓核症、中肠中后部变黄等症状。病毒基因组包含两条线性ssDNA分子(VD1和VD2),分别独立包装于病毒衣壳中。VD1编码的主要结构蛋白VP以及VD2编码的次要结构蛋白P133在BmBDV侵染家蚕的过程中发挥着重要的作用。前期研究表明,对BmBDV敏感的家蚕品系中肠细胞中表达一个含有12个跨膜结构域的氨基酸转运蛋白NSD-2。而在对BmBDV具抗性的家蚕品系的中肠细胞中所表达的NSD-2蛋白则缺失一段跨膜区域,由此推测NSD-2蛋白可能为BmBDV感染宿主细胞的潜在受体。本研究的主要目的包括:(1)构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系Bm N(+~(nsd-2));(2)体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))细胞系中研究病毒结构蛋白VP与NSD-2蛋白的相互作用;(3)研究BmN(+~(nsd-2))细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。本论文研究内容可分为以下三个部分:第一部分:构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系BmN(+~(nsd-2))。首先构建了表达BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的质粒pIZ-+~(nsd-2)并转染家蚕卵巢细胞BmN。利用pIZ-V5/His载体自带的Zeocin抗性筛选标记,对转染后的BmN细胞进行筛选。筛选传代30次后,获得稳定的家蚕细胞系BmN(+~(nsd-2))。通过western blotting和RT-PCR技术检测NSD-2蛋白的表达和+~(nsd-2)基因的转录,结果显示在BmN(+~(nsd-2))细胞中能够检测到NSD-2蛋白的表达以及+~(nsd-2)基因的转录;利用免疫荧光技术检测NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中的定位,结果显示NSD-2蛋白主要定位在BmN(+~(nsd-2))细胞的细胞膜上。第二部分:体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))细胞系中研究病毒结构蛋白与NSD-2蛋白的相互作用。利用昆虫表达载体pIB/pIZ-V5/His构建表达病毒主要结构蛋白VP以及次要结构蛋白P133的表达质粒,分别转染BmN(+~(nsd-2))细胞。制备了主要结构蛋白VP单克隆抗体,并依据VP蛋白的β桶结构构建了表达不同长度vp基因的质粒。运用western blotting检测VP和P133蛋白的表达,结果显示在BmN(+~(nsd-2))细胞中均能检测到VP蛋白、P133蛋白以及NSD-2蛋白的表达。为了研究NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP间的相互作用,使用VP单克隆抗体能够检测到VP与NSD-2-V5融合蛋白共沉淀;其次使用V5标签多克隆抗体,可以检测到NSD-2-V5融合蛋白与VP蛋白的共沉淀;结果表明VP与NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中具有相互作用。利用免疫荧光的方法检测到VP与NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中有共定位。这些研究结果显示NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP蛋白间存在相互作用。第三部分:研究BmN(+~(nsd-2))细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。以纯化的BmBDV病毒悬液(浓度:中肠肠干20 mg/mL)侵染BmN(+~(nsd-2))细胞。利用荧光定量PCR技术和免疫荧光技术检测BmBDV基因的转录以及病毒主要结构蛋白VP的表达,分析BmBDV对BmN(+~(nsd-2))细胞的侵染性。然而,在侵染的BmN(+~(nsd-2))细胞中免疫荧光实验并没有检测到病毒的入侵以及VP蛋白的表达;实时荧光定量PCR技术也没有检测到vp基因以及ns1基因的转录;暗示着BmBDV可能不入侵BmN(+~(nsd-2))细胞或者不能在细胞内复制。综上所述,本研究成功构建了稳定表达BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的家蚕细胞系Bm N(+~(nsd-2)),潜在受体蛋白NSD-2与病毒主要结构蛋白VP间存在相互作用且在BmN(+~(nsd-2))细胞中共定位;BmBDV可能不侵染BmN(+~(nsd-2))细胞系,表明NSD-2蛋白是主要但并不是病毒的唯一受体。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884.5
【图文】：

氨基酸序列,主要衣壳蛋白

图 1.1 BmBDV 的主要衣壳蛋白分析[21]Fig 1.1 Analysis of the major capsid protein of BmBDV[21]1.1.3 家蚕二分浓核病毒次要结构蛋白 P133病毒粒子次要结构蛋白 P133 由 VD2-ORF2 编码，是具有 1161 个氨基酸以及分子量为 133kDa 的大蛋白[22]。p133 基因与 vp 基因不同，其只编码单个结构蛋白。氨基酸多序列比对结果显示，P133 蛋白与一些呼肠孤病毒科病毒（如家蚕质形多角体病毒）的衣壳蛋白的 C-末端具有同源性，而且丝氨酸蛋白酶的 C末端也与 P133 蛋白的 C 末端具有相似性。CoCPV（云杉蓟马质型多角体病毒）VP3 氨基酸序列的 768-789 位氨基酸是亮氨酸拉链，此位置是结合 DNA 的特征序列；并且 P133 蛋白与 CoCPV VP3 的氨基酸序列在亮氨酸拉链区域都比较保

结构图,质粒,结构图,瞬时表达

因+nsd-2瞬时表达质粒的鉴定能够介导BmBDV侵染家蚕，是病毒的潜在受体，因细胞株对研究BmBDV的入侵机制较为关键。为了建in筛选标记的昆虫表达载体pIZ-V5/His并将目的基因了敏感性基因+nsd-2瞬时表达质粒pIZ-+nsd-2。质粒图谱的阳性质粒分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化处理目的基因大小与理论值相符，证实pIZ-+nsd-2瞬时表片段PCR扩增如图2.2A所示；pIZ-+nsd-2重组质粒酶切

结构图,PCR扩增,基因,酶切鉴定

基因+nsd-2片段PCR扩增如图2.2A所示；pIZ-+nsd-2重组质粒酶切鉴定如图2.2 B所示。图 2.1 pIZ-+nsd-2质粒结构图Fig 2.1 Schematic organizationof pIZ-+nsd-2plasmid

【参考文献】