家蚕BmRad23对受紫外线损伤的BmNPV作用的研究

发布时间：2020-08-02 10:01

【摘要】：核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair,NER)是非常重要的DNA损伤修复途径,能够对紫外线诱导的DNA损伤进行修复,并且有了广泛的研究。Rad23蛋白参与了损伤位点的识别过程,是NER中的一个很重要的修复蛋白。该蛋白在酵母和人体内的研究已经很多,但在家蚕体内很少研究。本文对BmRad23的亚细胞定位、功能等进行了初步分析。进而,分析了紫外线辐射、家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus,BmNPV)及家蚕细胞三者的相互影响,并通过过表达BmRad23及构建表达BmRad23的重组病毒来分析BmRad23对病毒活性及受紫外线损伤的病毒的修复的影响,为改造防紫外线辐射的杆状病毒提供理论依据。主要的研究结果如下:1.首先构建表达融合蛋白BmRad23-egfp的质粒,通过瞬时转染发现BmRad23主要定位在细胞核。宿主细胞反应实验表明过表达BmRad23能帮助修复受紫外线损伤的报告基因。2.接着我们分析了BmNPV、紫外线和家蚕细胞的相互影响。通过细胞活性分析、凋亡分析及病毒滴度实验等发现紫外线辐射降低了细胞活性,促使细胞凋亡,使病毒滴度下降。同时,受紫外线辐射的细胞不利于病毒的增殖。然而,在较高剂量的UV处理家蚕细胞后,BmNPV感染的细胞活性较未感染病毒的细胞更高,凋亡程度更低。RT-qPCR实验进一步发现无论家蚕细胞或BmNPV受到UV辐射后,家蚕DNA损伤修复基因BmRad23和BmRad4,BmNPV的损伤修复基因Bm65的表达均显著上升,推测UV辐射后家蚕宿主及病毒可能互相利用相关蛋白来进行损伤修复。而家蚕宿主细胞受到UV损伤后不利于病毒的增殖,病毒可能帮助宿主细胞尽快修复损伤,从而有利于自身更好地复制和增殖。同时,qPCR结果显示BmNPV感染后BmRad23及BmRad4的mRNA水平显著上升,推测在BmNPV的复制增殖中可能利用了宿主这些蛋白。3.进一步在BmN细胞内过表达BmRad23后,qPCR分析发现家蚕另一个损伤修复基因BmRad4及BmNPV的损伤修复基因Bm65的mRNA水平也随之升高。推测BmRad23通过影响其它DNA损失修复相关基因的表达进而促进家蚕及BmNPV修复UV诱导的损伤。接着对Bm65缺失型病毒BmNPV(Bm65KO)的损伤修复进行研究,结果发现用Bm65缺失型病毒和对照病毒分别感染宿主细胞时,BmRad23及BmRad4的表达相差不大。当这两种病毒分别受UV损伤后,对照病毒感染的细胞中BmRad23及BmRad4的mRNA显著高于用Bm65缺失病毒感染的细胞。我们推测病毒蛋白Bm65也可以通过影响家蚕宿主修复基因的表达来帮助修BmNPV自身的紫外线损伤。4.最后过表达BmRad23后,探究对病毒修复的影响。结果表明过表达该蛋白后有利于BmNPV的增殖,同时也有利于受UV损伤后的BmNPV的修复。接着我们构建了过表达BmRad23的重组病毒,并且对重组病毒进行滴度分析。结果表明插入修复基因BmRad23的重组杆状病毒,活性升高,对UV的抗性也增强。由此表明,以宿主修复蛋白BmRad23为代表的NER修复蛋白,对受紫外线损伤的BmNPV具有修复作用,为改造新型、高效的杆状病毒生物杀虫剂提供理论依据。同时,在紫外线辐射后,家蚕和BmNPV的DNA损伤修复基因互相影响,协同帮助修复宿主和病毒的紫外线损伤,为进一步探讨杆状病毒与宿主在进化中的相互博弈关系提供参考。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S884.5
【图文】：

家蚕 BmRad23 对受紫外线损伤的 BmNPV 作用的研究V 膜融合蛋白（envelope fusion protein，EFP）的不同，Alpha 杆状病毒Group I和Group II两种，其中 Group I以GP64 为出芽病毒（budded viru的融合蛋白，而 Group II 中没有 GP64 蛋白，以 F 蛋白作为其 BVs 白[7]。

图 1.2 杆状病毒的生活周期[11]Fig 1.2 Life cycle of baculoviru. 杆状病毒基因组研究杆状病毒在感染细胞后的表达具有时序性，一般分为三个阶段：早期基因和极晚期基因[12]。杆状病毒在基因组复制之前，早期基因为病毒御宿主抗性等生命活动编码所需的蛋白，如调控基因 IE-1、IE-2 和抵的 p35 等。这一过程一般发生在感染后 6 h 内，病毒一般利用宿主酶 II 来完成早期基因的转录，并且还需要早期转录激活因子 IE-1 的转录调控区域[13]。晚期和极晚期基因的转录一般发生在 6-12 h 和是病毒利用自身编码的 RNA 酶来编码病毒的结构蛋白和一些非必需衣壳蛋白 VP39 和 P10 等。尽管基因的编码有时间先后之分，但他们

江苏大学硕士论文皮肤的急性有害效应，过度紫外线辐射可使皮肤发生皮炎，其症状表现为皮斑，痒，水肿和水泡，尤其是 UVB，过量照射可促进皮肤的炎症发生和色累。 慢性光化性皮炎（Chronic actinic dermatitis，CAD）是一种罕见的炎性病，该病的主要特征是对光特别敏感，遇光或紫外线会产生皮炎，容易出现易见光器官，如耳、胳膊、手背等[64]。

【参考文献】

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2 王冰,藤田和子,山田武,内田信裕,三谷启志;C谱紫外线对体外培养小鼠胚细胞的影响[J];辐射防护;1997年03期

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本文编号：2778362