刺葡萄0943 VdWRKY70转录因子抗病功能分析

发布时间：2020-08-07 03:04

【摘要】：白腐菌是葡萄危害较严重的病害之一,因此有关葡萄抗白腐病的研究成为葡萄抗性研究的一个重要的方向。作为世界葡萄属植物起源中心之一,我国拥有很多宝贵的葡萄野生资源,其中一些品种对白腐菌具有抗性,尤其是刺葡萄0943对白腐菌具有很强的抗性。本课题前期研究发现,中国野生种刺葡萄0943对白腐病抗性很强,且发现Vd WRKY49和Vd WRKY53转录因子在刺葡萄抗白腐病中具有重要作用。为了进一步研究刺葡萄0943抗病品种中与抗性有关的基因,该试验以美人指为对照研究VdWRKY70转录因子的抗病功能。本研究的内容和结论如下:本研究主要取得以下成果:1、通过刺葡萄0943和美人指接白腐菌表型观察和接菌后不同时期台盼蓝染色观察,发现刺葡萄0943抗白腐能力较强。通过分析刺葡萄0943和美人指中SA、JA含量变化与WRKY70相关抗病基因NPR1、PR1相对表达量的变化趋势,发现VdNPR1和VdPR1的变化趋势与SA含量变化趋势一致,因此推测Vd WRKY70主要通过SA途径调控刺葡萄0943抗白腐病功能。2、通过拟南芥原生质体定位和核定位分析发现,VdWRKY70具有核定位信号,定位到拟南芥细胞核中。3、通过转VdWRKY70拟南芥苗的培养,用野生型拟南芥作对照,同时接白腐菌、白粉菌和Pst DC3000,通过接菌一定时间后表型观察、台盼蓝染色、数量性状统计一系列手段,发现转基因拟南芥抗病能力均比野生型拟南芥强。将拟南芥接菌后SA含量的变化与Vd WRKY70、At NPR1、AtPR1相对表达量的变化分析,进一步研究Vd WRKY70在SA途径中的抗病性。结果发现,转基因拟南芥接不同类型菌后AtNPR1、AtPR1相对表达量与SA含量的变化趋势基本一致。4、通过聚类分析,发现VdWRKY70蛋白序列与FcWRKY70,CaWRKY70,AtWRKY70,AtWRKY54以及ClWRKY70聚在一起,表明它们在功能上也有一定的相似性。5、用同源克隆的方法获取刺葡萄0943和美人指的启动子序列,通过序列比对和顺式作用元件分析发现,VdPR1和VvPR1启动子序列具有一定的差异,其中Vd PR1比Vv PR1多26bp,且有SA途径相关顺式作用元件,因此推测VdWRKY70转录因子在SA途径中可能与VdPR1启动子相结合发挥作用。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.631
【图文】：

刺葡萄,白腐菌,指接,表型

第 3 章结果与分析第 3 章结果与分析3.1 葡萄接白腐菌后表型观察将‘刺葡萄 0943’和美人指用针刺法分别接种白腐菌，并用清水作为对照。从图 3-1 可以看出，用针刺法在美人指和‘刺葡萄 0943’伤口处分别用清水处理作为对照（CK），发现美人指和‘刺葡萄 0943’的对照并无出现症状。但在接菌 5d 后，美人指接菌处出现明显的病斑，‘刺葡萄 0943’几乎没有病斑的出现，说明‘刺葡萄 0943’的抗白腐病能力要强于美人指。VIM CK VIM 5dpi VAC CK VAC 5dpi

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图 3-1‘刺葡萄 0943’和美人指接白腐菌表型观察Fig. 3-1 Phenotypic observation of C. diplodilla in VAC and VIM3.2 葡萄接白腐菌台盼蓝染色观察为进一步研究‘刺葡萄 0943’的抗白腐病的能力和抗病机制，将‘刺葡萄 0943’和美人指接白腐菌后各时期的新鲜叶片进行台盼蓝染色，观察各时期葡萄叶片细胞被杀死的情况。研究发现在接菌后 0-24 h，‘刺葡萄 0943’叶片接菌处染色情况比美人指较为严重，之后染色面积扩大范围较小，但美人指在接菌 24 h 后，染色面积明显增大。说明在接菌 24 h 后‘刺葡萄 0943’细胞死亡较少，而美人指细胞死亡数量明显要比刺葡萄多。说明‘刺葡萄 0943’的抗白腐病能力比美人指强。0h 24h 48h 72h 96h

拟南芥,原生质体,荧光,次生物

图 3-4 VdWRKY70 及相关抗病基因表达量时荧光定量分析 WRKY70 及 NPR1，PR1 的表达量。试验进行 3 次重复，SD次生物学重复的标准偏差，小写字母为 p<0.05 水平上的差异显著性。Fig. 3-4 Expression of VdWRKY70 and related disease resistance genestive expression levels of WRKY70, NPR1 and PR1 were analyzed using qRT-PCR. he mean±SD from three independent experiments. Statistically significant differenare indicated by lower-case letters (P < 0.05; Student’s t-test).RKY70 的亚细胞定位WRKY70 转入拟南芥原生质体，分别从目标蛋白荧光通道、Marke绿体荧光通道、明场、叠加图几种途径观察 VdWRKY70 在拟南芥。红色标识的箭头即为 VdWRKY70 定位的位置，从原生质体定位dWRKY70 主要定位在拟南芥的细胞核中。说明 VdWRKY70 主要0h 12h 24h 48h 72h接菌时间(hpi)

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