百岁兰曲霉（Aspergillus welwitschiae）对水稻拟禾本科根结线虫（Meloidogyne grami

发布时间：2020-08-07 06:41

【摘要】：拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)是水稻种植系统中危害最为严重的病原线虫之一。目前广泛应用的化学杀线虫剂对环境危害较大且使用成本较高,亟待筛选出对环境有益且易于推广的绿色防控技术来替代化学杀线虫剂。本研究以拟禾本科根结线虫为研究对象,通过形态学和分子生物学手段鉴定了一株生防真菌AW2017,通过优化杀线虫代谢产物的发酵工艺,探究了最适宜的发酵培养条件;通过室内生测和盆栽试验、巨细胞组织切片及水稻防御相关基因的表达分析,进一步明确百岁兰曲霉对拟禾本科根结线虫的作用机制,以期为开发防控拟禾本科根结线虫的生防菌剂、发展绿色防控技术提供理论依据。主要研究结果如下:经形态学特征和分子生物学分析,AW2017菌株与曲霉属形态非常相似、且Cam与BenA基因与百岁兰曲霉的同源性分别高达75%和89%,从而将AW2017鉴定为百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)。通过室内生物测定,评价了百岁兰曲霉孢子悬浮液对水稻根结线虫幼虫和卵的毒力,发现5×AW2017处理72 h后,根结线虫幼虫死亡率高达86.2%;处理8天后,根结线虫卵孵化抑制率达47.3%,表明百岁兰曲霉孢子悬浮液对水稻根结线虫幼虫有良好的毒杀作用,对于卵孵化也有较好的抑制作用。通过室内接种实验,测定了百岁兰曲霉孢子悬浮液对根结线虫行为的影响。诱集实验表明,与PDB对照相比,在距离接种中心1.5-3.0cm和3.0-4.5cm的区域,5×AW2017处理分别可降低线虫的迁移率37.3%和39.6%,侵入根部的线虫减退率高达64.9%。温室盆栽实验表明,施用5×AW2017孢子悬浮液后,根结数量可降低24.5%,根内侵入的线虫数量减少40.5%,且侵入的线虫发育进程明显延缓。显微切片结果表明,AW2017处理后的巨细胞比对照表面积减小了77.6%,发育明显延迟。说明AW2017减少水稻根系对拟禾本科根结线虫的诱集作用,减少根内线虫的侵入数量并抑制其发育。在原有摇瓶发酵的基础上,对百岁兰曲霉在500 L发酵罐中产生杀线虫活性代谢物的发酵工艺进行了优化。确定了接种体积为8%、通气量为4m~3/h、溶氧水平为25%的菌种最佳发酵培养条件,同时明确了菌种最佳发酵培养时间为120h。在该条件下,以PDB为对照,AW2017的线虫校正死亡率高达91.3%,说明该发酵体系可用于AW2017杀线虫活性物质的量化生产。通过qRT-PCR分析,初步研究了AW2017对水稻防御相关基因表达的影响。分别在接种6h和72h后,AW2017发酵液处理的水稻根系内ET合成相关基因OsACO7和OsACS1的相对表达量明显上调;但测试时间内ET响应基因OsERF1、OsERF70、OsEBP89以及调控基因OsEIN2的相对表达量变化不显著。此外,AW2017处理后,水稻根内其他信号途径的相关基因表达量无显著变化。说明AW2017可能通过诱导ET合成途径相关基因表达量上调来防御根结线虫的侵入。综上所述,百岁兰曲霉代谢产物可抑制根结线虫的侵入和发育,激活水稻防御相关基因的表达,能有效控制拟禾本科根结线虫的危害,具有良好的开发应用潜力。本研究为开发水稻根结线虫生防菌剂、发展线虫绿色防控技术提供了新思路。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.4
【图文】：

分生孢子,孵化率,球形,线虫

子悬浮液0.5ml和10×AW2017孢子悬浮液0.5ml，再加入0.5ml卵悬浮液（200个/ml），PDB为对照，总体积为1ml。每个处理重复6次，每组试验重复三次。将24孔板放到26℃的恒温箱中孵化并用封口膜封严实，防止孔板内水分蒸发和杂菌污染。分别统计放置4天和8天后线虫虫卵孵化的情况，显微镜下统计卵和线虫的数量，并通过SAS软件分析卵的孵化率和孵化抑制率（Saikia etal.,2013）。孵化率=（孵化线虫数/卵总数量）×100%，孵化抑制率=（对照组孵化率-处理组孵化率）/对照组孵化率×100%。2.2 结果分析2.2.1 真菌 AW2017 的形态学鉴定真菌 AW2017 在查氏酵母膏琼脂(CYA)上 25℃培养 5 天后，测得菌落直径范围约 43-45mm，较厚, 表面具少量辐射状皱纹, 边缘于培养基内；质地绒状；分生孢子结构大量产生，褐黑色；菌丝体白色夹杂淡黄色；无渗出液和可溶性色素；反面呈淡黄白色。分生孢子头初期为球形，老后分叉，直径范围约 200-400μm；分生孢子梗发生于培养基内部，长×宽大小范围大约 1000-3000×10-18μm，壁光滑；顶囊球形直径 40-60μm，全部表面可育；产孢结构双层，梗基的长×宽大小范围大约 10-20×5-7μm；瓶梗的长×宽大小范围大约 8-10×2-3μm；分生孢子球形，壁刺状粗糙（图 2.1）。

序列,曲霉,基因,ITS区

士学位论文第二章百岁兰曲霉生防真菌的分离鉴定及其对拟禾本科根Fig.2.a.Characteristics of colonies;b-d.Conidiophorc and conidia2017 的分子生物学鉴定 BenA 基因 ITS 区片段以及 CAM 基因的 ITS 区片段经过 PCR 扩化、单克隆阳性检测后送去测序，测得菌株 BenA 基因 ITS 区片小分别为 556bp 和 616bp（图 2.2），GenBank 编号分别为 MH021属与同属其他种的亲缘关系，将编辑后的序列在 GenBank 上进行下载相似的菌株序列，利用 MEGA6.0 软件中的邻位连接法构建株 AW2017 的两个片段均与 A. welwitschiae 在同一分支，其中， welwitschiae CBS 139.54 (FJ629291.1)的同源相似性最高，高达 89%chiae CBS 139.54 (KC480196.1)的同源相似性最高，高达 75%（图分子生物学分析，将菌株 AW2017 鉴定为百岁兰曲霉（A. welwi

检验值,数字表示,分支

13Fig.2.3 The NJ tree inferred from the partial sequences of β-tubulin (A) and calmodulin (B) of Aspergillus welwitschiae.Bootstrap percentages >35% derived from 1000 replicates are indicated at the nodes. Bar=0.02 substitutions pernucleotide position.：分支上数字表示大于 35%的 Bootstrap 检验值（1000 次重复）

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