葡萄座腔菌dsRNA病毒鉴定及功能分析

发布时间：2020-08-10 16:52

【摘要】：葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是危害林果病害的重要病原菌,危害严重。真菌病毒作为一类重要的生防因子,有望在该类病害病菌中发现和应用。本研究以19个B.dothidea菌株为出发菌株,通过对其中13个菌株真菌病毒的提取、分离、鉴定及功能分析,明确B.dothidea真菌病毒的分类地位及功能,为明确B.dothidea真菌病毒的系统演化及生物防控新的思路提供依据,主要研究结果如下:筛选出了dsRNA病毒高效的分离方法以sdau11-122和sdau11-64为供试菌株,选用水饱和酚作为抽提剂和真菌RNA提取酶切法进行比较,以操作的方便性和dsRNA的提取的质量两个指标为标准,筛选出真菌RNA提取酶切法是提取B.dothidea dsRNA病毒是高效的方法,该方法的提取时间缩短了一半,提取的质量好。其他sdau11-65、sdau11-71等17个菌株按此方法进行了dsRNA的提取,验证了方法的高效性且发现病毒具有多样性。明确B.dothidea部分菌株dsRNA病毒的分类地位通过全基因测序、BLAST比对,发现sdau11-122菌株的病毒的RdRp大小为1408 bp,CP基因大小为1562 bp,通过同源性对比,其与Botryosphaeria dothidea partitivirus 1的同源性达到了99%,属于双分体病毒科(Paritiviridae)双分体病毒属(Partitivirus),命名为BdPV2;sdau11-64菌株的病毒序列片段大小为5161 bp,经对比后发现其与Sphaeropsis sapinea RNA virus 1的同源性达到了99%,属于整体病毒科(Totiviridae)维多利亚病毒属(Victorivirus),将其命名为Botryosphaeria dothidea Victorivirus 2(BdVV2),这是首次在B.dothidea中发现该种真菌病毒。明确了13个真菌病毒的功能通过对13个野生菌株采用原生质体制备、结合病毒唑得到脱毒菌株,提取病毒粒子并转染获得再生菌株,通过测定野生菌株、脱毒菌株和再生菌株在菌落颜色、菌落生长特性和人工刺伤接种方法,研究结果表明:脱毒菌株sdau11-119和sdau11-65与野生及再生菌株颜色差异表现较小其他菌株颜色均有一定差异;sdau11-122、sdau11-71、sdau12-60等菌株野生、脱毒及再生菌丝生长速率无差异,致病力测定野生菌株和再生菌株病斑较大,而脱毒后的菌株病斑的较小,说明病毒对病原菌具有促生作用;sdau11-64、sdau11-119、sdau11-86、sdau11-80、sdau12-40等菌株生长速率脱毒菌株高于野生及再生菌丝,致病力测定野生菌株和再生菌株病斑较小,而脱毒后菌株病斑较大,存在弱毒现象,致病力较弱,具有重要的生防价值。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476
【图文】：

真菌,真菌病毒,琼脂糖凝胶电泳,病毒提取

山东农业大学硕士学位论文析ea dsRNA 病毒提取方法的筛选othidea 菌株中提取高质量的 dsRNA 病毒，以 sdau11-12和酚抽提法和酶切法两种方法同时取菌株等量的菌丝进的琼脂糖凝胶电泳进行检测（如图 1），根据结果显示呈弥散状且条带不亮，说明在抽提过程中出现降解或者 dsRNA 条带相对较为清晰且量大，说明通过真菌 RNA，且此类方法能够高效的节约时间，可用于后续 B. doth

菌株,片段,葡萄座腔菌,功能分析

葡萄座腔菌 dsRNA 病毒鉴定及功能分析及 sdau12-93 片段大小相似，其中 sdau11-64 和 sdau11-122 均为 5000 bp 和 2500 bp 左sdau11-71 片段大小在 2300bp-2500 bp;而 sdau12-60 片段较小约为 4500 bp 以及 2300 bpsdau11-118 以及 sdau11-123 未检测到 dsRNA，上述结果显示 dsRNA 在菌株中普遍存具有多样性。

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山东农业大学硕士学位论文上的为 1545 bp；而从 sdau11-64 中分离出来的病毒序列经过 BLAST 对比后与 Sphaeropsissapinea RNA virus 1 的同源性达到了 99%（图 4），属于整体病毒科（Totiviridae）维多利亚病毒属（Victorivirus），将其命名为 Botryosphaeria dothidea Victorivirus 2（BdVV2）。BdVV2序列长度为 1562 bp,sphaeropsis sapinea RNA virus 1 的序列全长为 1623 bp，完全对比上的为 1545 bp。

【参考文献】