核桃叶杀虫活性及生化机制的研究

发布时间：2020-08-13 20:12

【摘要】：核桃叶为植物胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)的树叶,其资源丰富并存在一定的杀虫活性。本文研究了核桃叶对三种农业害虫小菜蛾(Plutella xylostella L.)、棉蚜(Aphis gossypii G.)和菜青虫(Pieris rapae L.)的杀虫活性。以参与免疫防御的关键酶-酚氧化酶为靶点进行研究,阐明核桃叶杀虫的作用机制,为核桃叶靶向杀虫提供理论依据。(1)测定核桃叶50%、70%、90%乙醇提取物对小菜蛾、棉蚜和菜青虫的杀虫活性。实验表明:70%乙醇提取物的胃毒活性最强,棉蚜小菜蛾菜青虫,其中棉蚜施药30 h和48 h的致死中浓度分别为11.70 mg/mL和5.07 mg/mL;小菜蛾施药3 d和4 d的致死中浓度分别为16.92 mg/mL,8.31 mg/mL;菜青虫施药3 d和4 d的致死中浓度分别为21.55 mg/mL和13.86 mg/mL。70%乙醇提取物对棉蚜的触杀活性最好,25 mg/mL接触48 h杀虫率达到80.15%;90%乙醇提取物对小菜蛾和菜青虫的触杀活性最好,同样条件下杀虫率达71.23%和56.12%。70%乙醇提取物对小菜蛾的生长抑制效果最好,24 h体重抑制率达34.12%;90%乙醇提取物对菜青虫的生长抑制效果最好,24 h体重抑制率为41.23%。90%乙醇提取物对三种试虫拒食活性最强,48 h的非选择性和选择性拒食活性均为棉蚜(81.96%,87.74%)菜青虫(75.75%,79.35%)小菜蛾(61.20%,65.23%)。(2)以小菜蛾为昆虫模型,探究核桃叶70%乙醇提取物杀虫的作用机制。实验表明:核桃叶提取物在给药初期可以激活小菜蛾体外血淋巴的黑化,3d后黑化又被抑制。中间产物多巴的含量随着给药浓度的增加而升高,验证了核桃叶对黑化反应的激活作用。在蛋白质水平上,核桃叶70%乙醇提取物对血淋巴中蛋白含量产生影响,以给药48 h为分界点,蛋白质含量增后降低,变化浮动在10%左右。在血糖水平上,血淋巴中海藻糖的含量随着提取物浓度的增加而降低,随着时间的变化在昆虫体内的含量先增加后减少。(3)探究杀虫过程中靶点-酚氧化酶的活性及蛋白和基因的表达量差异。酶学特性实验表明:小菜蛾酚氧化酶在pH = 6-6.8范围内稳定性较好,最适pH值为6.4,在20-40℃酶活相对稳定,最适温度为34℃。70%乙醇提取物在体外对小菜蛾酚氧化酶有激活作用,给药浓度9 mg/mL时,激活率达到35.09%。在体内对4龄虫的激活作用最强,测定对四龄虫不同组织的激活作用,血淋巴表皮头部。通过qRT-PCR和SDS-PAGE分别检测小菜蛾酚氧化酶的mRNA和蛋白的表达情况,结果均表现出给药浓度越高其表达量越高的情况,表明70%乙醇提取物至少会促进酚氧化酶基因转录水平的表达,是否直接促进翻译水平的表达还需进一步验证。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ453
【图文】：

铜活性,酚氧化酶

（酚氧化酶原）逦（酚氧化酶）逡逑图１－５酚氧化酶激活系统逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑（ｉ）分子结构逡逑ｍ型铜蛋白家族包括节肢动物和软体动物的血蓝蛋白，以及微生物、脊椎动物和逡逑植物的氧化还原酶，昆虫酚氧化酶也是其中一员［５１］。如图１－６，它可以通过其独特的逡逑二聚体活性位点ＣｕＡ和ＣｕＢ来进行识别，中心铜原子由三个组氨酸（Ｈｉｓ）来支撑，逡逑和氧在桥接偏移方向0１－十：ｒｆ）结合［５Ｘ｜，且三个组氨酸残基分布存在一定的差异。酶逡逑催反应进行时，酚氧化酶双铜活性中心有三种氧化还原状态，分别包括脱氧态、还原逡逑态和氧化态。氧化态的酶既能催化单酚的羟基化，又能催化邻苯二酚成相应的醌，而逡逑还原态的酶只能进行后一个反应。逡逑Ｈｉｓ逡逑ｔ逡逑Ｈｉｓ蠢逡逑曹ＣｕＡ逡逑，、、：：？？Ｈｉｓ逡逑0逡逑？邋Ｈｉｓ逡逑图１－６酚氧化酶双铜活性中心逡逑Ｆｉｇ．邋１－６邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｅａｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｃｅｎｔｅｒ邋ｏｆ邋ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ逡逑昆虫的酚氧化酶与节肢动物血蓝蛋白具有高达４０％的序列同源性［５３】

小菜蛾,周期图,化蛹,胃毒

Ｆｉｇ．２－４邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（Ａ：邋ｆｉｒｓｔ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｂ：邋ｓｅｃｏｎｄ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｃ：邋ｔｈｉｒｄ逡逑ｉｎｓｔａｒ，邋Ｄ：邋ｆｏｕｒｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｅ：邋ｆｉｆｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｆ：邋ｐｕｐａｌ邋ｄｕｒａｔｉｏｎ）逡逑对小菜蛾进行触杀和胃毒实验，如图２－５，图ａ为小菜蛾的触杀试验，１为接触给逡逑药后小菜蛾的异常行为，身体开始卷曲，用毛刷触碰后行动缓慢且一直保持卷曲状态。逡逑图ｂ为小菜蛾的胃毒试验，２为给药后小菜蛾的失水皱缩情况。图ｃ和图ｄ为对照组逡逑和胃毒试验死亡后的小菜蛾，可以看出小菜蛾在给药后身体变得干瘪，颜色加深变为逡逑褐色且用毛刷触碰无反应，表现为死亡。逡逑ａ邋、逦ｂ邋＼逦ｃ邋＾逡逑＞、，、邋钱逡逑Ｊ邋＇逦，、邋ｄ邋身逡逑图２－５小菜蛾触杀与胃毒活性对比（ａ：触杀试验，ｂ：胃毒试验，ｃ：对照，ｄ：胃毒死亡，１：异常，２：逡逑失水）逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔａｇ邋ａｎｄ邋ｓｔｏｍａｃｈ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（ａ：邋ｔａｇ邋ｔｅｓｔ

胃毒,触杀,小菜蛾

１０邋１１邋１２邋１３邋ｔｏ邋１１邋１２邋１３逦１０邋１１逦１３逡逑１０逦１１逦１２邋ＩＳ邋ｔｏ邋１１逦１２逦１３邋１０逦１１逦１２逦１３逡逑图２－４小菜蛾幼虫生长周期图（Ａ：邋ｌ龄，Ｂ：邋２龄，Ｃ：邋３龄．Ｄ：邋４龄，Ｅ：邋５龄，Ｆ：化蛹）逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（Ａ：邋ｆｉｒｓｔ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｂ：邋ｓｅｃｏｎｄ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｃ：邋ｔｈｉｒｄ逡逑ｉｎｓｔａｒ，邋Ｄ：邋ｆｏｕｒｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｅ：邋ｆｉｆｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｆ：邋ｐｕｐａｌ邋ｄｕｒａｔｉｏｎ）逡逑对小菜蛾进行触杀和胃毒实验，如图２－５，图ａ为小菜蛾的触杀试验，１为接触给逡逑药后小菜蛾的异常行为，身体开始卷曲，用毛刷触碰后行动缓慢且一直保持卷曲状态。逡逑图ｂ为小菜蛾的胃毒试验，２为给药后小菜蛾的失水皱缩情况。图ｃ和图ｄ为对照组逡逑和胃毒试验死亡后的小菜蛾，可以看出小菜蛾在给药后身体变得干瘪，颜色加深变为逡逑褐色且用毛刷触碰无反应，表现为死亡。逡逑ａ邋、逦ｂ邋＼逦ｃ邋＾逡逑＞、

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