柞蚕羽化激素相关基因表达及海藻糖酶活性的研究

发布时间：2020-08-14 07:05

【摘要】：滞育(diapause)是昆虫重要的生理状态,主要表现为生长发育的停滞和生理活动的降低,应对外界不利的条件以保持物种的延续。柞蚕(Antheraea pernyi)是以蛹滞育的鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,是我国特色的经济昆虫。柞蚕蛹进入滞育及解除滞育是柞蚕种保护及制种的重要环节,而关于其激素调控机制的研究是实现人为控制柞蚕不同化性地区柞蚕蛹羽化制种的基础。因此,关于柞蚕滞育及滞育解除机制的研究对于柞蚕生产、阐明机制具有重要意义。选取沈阳农业大学柞蚕研究所保育的“沈黄2号”和河南省蚕业研究所保育的“豫大1号”为材料,运用分子生物学方法,研究柞蚕滞育及解除滞育过程中羽化激素、脱壳启动激素和脱壳启动激素受体基因以及糖代谢调控中的海藻糖酶基因的表达规律,为阐明柞蚕蛹滞育及其解除滞育机制奠定基础。结果如下:1.柞蚕羽化激素基因的克隆及表达模式研究根据本实验室建立的柞蚕中肠转录组数据库筛选注释为羽化激素基因的Unigene序列,利用Primer premier 5.0软件设计引物,克隆获得了柞蚕羽化激素基因ApEH。ApEH基因的ORF序列全长为267 bp,编码88个氨基酸;半定量RT-PCR检测ApEH基因在柞蚕蛹滞育期和发育期各个组织中表达情况,ApEH在柞蚕蛹滞育期和发育期的脑和滞育期的精巢/卵巢中高表达,在发育期体壁高表达,在其它组织中微量表达。采用qRT-PCR检测长光照处理滞育蛹后,ApEH的表达量在0至21 d之间维持在较低的表达水平,而在21 d时EH的表达量开始升高,第35 d达到最高(为预蛹的15.85倍),之后开始下降,49 d达到最低。结合呼吸强度测定结果,长光照加速解除柞蚕滞育并促进其发育,表明柞蚕滞育蛹在长光照处理20天以内,没有启动羽化程序,21天以后开始启动羽化程序。2.柞蚕脱壳启动激素和脱壳启动激素受体基因的克隆及表达模式研究根据柞蚕中肠转录组数据库,利用Primer premier 5.0软件设计引物。克隆获得了柞蚕脱壳启动激素和脱壳启动激素受体基因,分别命名为ApETH和ApETHR-A。2个基因的ORF序列全长分别为264 bp、1 653 bp,分别编码87、550个氨基酸。半定量RT-PCR检测这2个基因在柞蚕蛹滞育期和发育期各个组织中表达情况,ApETHR-A在柞蚕蛹滞育期和发育期的脑中高表达;ApETH在滞育期的体壁中高表达,在发育期精巢/卵巢中高表达,在其它组织中不表达;ApETHR-A在滞育期精巢/卵巢中高表达,在发育期体壁高表达,在其它组织中都微量表达。采用qRT-PCR检测长光照处理滞育蛹后,ApETH在幼虫刚化蛹而体壁未硬化和黑化时(俗称“神仙蛹”)时表达量较高,长光照处理滞育蛹后,开始下降,在处理21 d时,表达量最低,随后开始升高,在49 d时,表达量最高;ApETHR-A先升高,在0 d时相对表达量较高,长光照处理滞育蛹后,慢慢下降,起伏不定,在35 d时表达量最低,在光照49 d时,表达量最高。表明柞蚕蛹临近羽化过程中,羽化激素、脱壳启动激素和脱壳启动激素受体基因的表达变化趋势基本呈一致性,提示3个基因的表达响应在柞蚕蛹临近羽化中发挥重要作用。3.柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中海藻糖酶基因的克隆及表达模式研究根据柞蚕中肠转录组数据库,利用Primer premier 5.0软件设计引物。克隆获得了柞蚕3个海藻糖酶基因,分别命名为ApTreh1A,ApTreh1B和ApTreh2(GenBank登录号分别为:KU977455,KU977456和KU977457),开放阅读框(ORF)全长分别为1 797、1635、1 932 bp,分别编码598、544、643个氨基酸。同源序列比对与系统进化树分析表明,ApTreh1A和ApTreh1B为可溶型海藻糖酶(TrehS),ApTreh2为膜结合型海藻糖酶(TrehM)。半定量RT-PCR检测发现,各组织中ApTreh2比ApTreh1的分布更广且表达量更高。qPCR检测发现,ApTreh1A和ApTreh1B在长光照处理后的柞蚕蛹脂肪体中,21 d时表达量都表现出快速升高[分别是对照组(12L:12D)的2倍和4.7倍],28 d与35d时下降,42 d时表达量再次升高;ApTreh2随着滞育的解除表达量逐渐升高,28 d时达到最高(约为对照组的2.7倍),42 d时又出现一个小高峰(约2.3倍),后期逐渐下降。4.柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中海藻糖酶活性及海藻糖含量变化研究利用3,5-二硝基水杨酸法检测脂肪体中海藻糖酶活力的变化,同时采用蒽酮比色法测定其血淋巴中海藻糖含量。长光照下脂肪体中海藻糖酶活力逐渐升高,21 d时达到最高(约18.5 U),35 d时降到最低(约11.2 U),42 d时其酶活力再次略微升高,之后呈下降趋势,与基因表达变化趋势一致。蛹血淋巴中海藻糖含量在长光照条件下呈现出升高趋势,21 d时达到最高,在整个发育时期的含量比对照组要高。本研究结果表明柞蚕蛹滞育解除过程中海藻糖酶基因表达的变化与蛹脂肪体中海藻糖酶活性、蛹血淋巴中海藻糖含量的变化趋势呈一致性,提示海藻糖酶基因的表达响应在柞蚕蛹滞育解除中发挥重要作用。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S885.1
【图文】：

柞蚕,基因,家蚕,序列特征

及质量检测RNA 要求极高，提取的柞蚕定 RNA 的浓度和质量，结果HR-A 基因的克隆与序列特征为模板，用反转录试剂盒合成克隆的三个基因的 PCR 长度基因序列，通过 BlastP 比对与家蚕 EH、家蚕 ETH、家蚕 E分别将这 3 个基因命名为 AbpM 1 2 3

滞育期,柞蚕蛹,基因,体壁

精巢/卵巢中高表达，在发育期体壁高表达，在其它组织中都微量表达。ETH在滞育期的体壁中高表达，在发育期精巢/卵巢中高表达，在其它组织中不表达。ETHR-A在滞育期精巢/卵巢中高表达，在发育期体壁高表达，在其它组织中都微量表达（图3-1）。1: 血淋巴Haemolymph; 2: 中肠Midgut; 3: 体壁Integument ; 4: 精巢/卵巢Spermaries/ovaries; 5: 脂肪体 Fat body; 6: 脑 Brain图 3-1 半定量 RT-PCR 检测 EH、ETH、ETHR-A 基因在柞蚕蛹滞育期和发育期不同组织器官中的表达量Fig. 3-1 Expression profile of EH、ETH、ETHR-A in different tissues of diapause stage and developmentstage of Antheraea pernyi pupae assayed by semi-quantitative RT-PCR3.5.2 实时定量 PCR（qPCR）引物特异性分析qPCR引物特异性是保证qPCR结果准确的重要条件之一，在检测柞蚕蛹滞育与滞育解除过程中ApEH、ApETH和ApETHR-A基因的相对表达量时发现，柞蚕内参基因β-actin和ApEH、ApETH和ApETHR-A基因具有不同的溶解峰（图3-2），没有其他的杂峰出现，说明qPCR引物具有较好的特异性

溶解曲线,滞育蛹,预蛹,光照

图3-2 qPCR溶解曲线Fig. 3-2 The melting curve of qPCR3.5.3 滞育解除过程中 ApEH、ApETH 和 ApETHR-A 的表达量变化采用 qRT-PCR 检测柞蚕蛹解除滞育及发育过程中 EH、ETH 和 ETHR-A 的相对表达量。长光照处理滞育蛹后，EH 的表达量在 0 至 21 d 之间维持在较低的表达水平，而在21 d 时 EH 的表达量开始升高，第 35 d 达到最高（为预蛹的 15.85 倍），之后开始下降，49 d 达到最低，短光照处理除了在第 7 d 和第 42 d 较低之外，其余时间表达量基本一致（图 3-3：A）；ETH 在神仙蛹时表达量较高，长光照处理滞育蛹后，开始下降，在处理21 d 时，表达量最低，随后开始升高，在 49 d 时，表达量最高（为预蛹的 43.12 倍），短光照处理后，表达量稍微上升，第 14 d 表达量达到最高，之后开始下降，第 42 d 表达量最低，第 49 d 稍微上升（图 3-3：B）；ETHR-A 先升高，在 0 d 时相对表达量较高，长光照处理滞育蛹后，慢慢下降，起伏不定，在 35 d 时表达量最低，在光照 49 d 时，表达量最高，短光照处理滞育蛹后，慢慢下降，起伏不定，在 14 d 时表达量最低，在光照 42 d 时，表达量最高，随后下降（图 3-3：C）。

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