猕猴桃应答溃疡病菌侵染的转录组研究及抗性相关基因挖掘

发布时间：2020-08-19 12:07

【摘要】：猕猴桃因其具有丰富的营养物质被誉为“水果之王”。近年来,随着猕猴桃栽培面积的不断增长,其病害情况也日益严重,尤其是猕猴桃细菌性溃疡病的发生,该病害致病性强、传播速度快,能够在短时间内造成植株的大面积死亡,严重影响了世界猕猴桃产业的发展。为了阐明猕猴桃应答溃疡病菌侵染的分子机制,本研究选取国家农作物种质资源平台猕猴桃子平台中29个猕猴桃品种(系),对其抗病性进行评价;选择其中高抗品种‘华特’和高感品种‘红阳’作为材料,利用RNA-Seq测序技术,分析了猕猴桃在受到病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidiae(Psa)侵染后不同时间点的基因表达变化,筛选出了4类与抗病相关的基因;并在此基础上,详细研究了植物病程相关蛋白1(PR-1)的结构和功能。主要研究结果如下:1.猕猴桃品种(系)溃疡病抗性鉴定及不同评价指标的相关性分析(1)对29个不同猕猴桃品种(系)离体枝条接种Psa,逐日观察症状发现:接种6天后,部分品种(系)开始发病,接种点变红褐色,有少量或者溢出乳白色黏液,随着接种时间的延长,病斑直径也越来越大。在接种21天后,计算枝条的病情指数,对其抗病性进行评价,结果发现,C2-72、C红阳表现为高感(HS),D6-65、C1-74、CHort16-A、D14-57、D6-20表现为感病(S),C2-43、C金桃、C金艳、D优系-52表现为耐病(T),D徐香、D海沃德、D布鲁诺、A红宝石星、ASE1-5、AP1-2、AP4-2、EN4-32、AP6-1、AP3-3、A11-17、EN4-25、EN14-9、D金魁和D陶木里表现为抗病(R),EN12-16、EN12-31和E华特表现为高抗(HR),以上结果表明不同猕猴桃品种(系)抗病性存在显著性差异,其中中华猕猴桃抗病性最差,美味猕猴桃抗病性次之,软枣和毛花猕猴桃抗病性最高。(2)对离体枝条病斑长度和病情指数进行了相关性分析,结果表明两者呈现极显著性正相关,相关系数r为0.957,病情指数越高,病斑长度越大,说明病斑长度也可以作为猕猴桃溃疡病病害鉴定的重要指标。(3)用流式细胞仪对29个猕猴桃品种(系)进行倍性检测,结果表明4倍体中华类型品种抗病性要强于2倍体中华类型品种,而在种间,倍性对抗性的影响不大。2.高抗品种‘华特’和高感品种‘红阳’在受到Psa侵染后的转录组分析(1)从‘华特’和‘红阳’不同时间点差异表达基因分析可以看出,在受到Psa侵染后,抗病品种‘华特’能够迅速的响应Psa的侵染,推测猕猴桃对溃疡病菌的防御反应可能集中在侵染12h前的早期反应,早期的差异表达基因可能在抗病反应中起到更重要的防御作用。(2)基因共表达网络分析结果表明在‘华特’和‘红阳’中有5个模块的基因表达存在着显著的差异。对这5个模块中的基因进行了KEGG富集分析,结果发现,MEgreenyellow模块和MEyellow模块的差异表达基因主要富集在植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction)、内吞作用(Endocytosis),在MEblack模块的差异表达基因主要富集在内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction),这些可能都是与猕猴桃响应抗病反应密切相关的途径。3.以高抗品种‘华特’和高感品种‘红阳’为材料,分别克隆其病程相关蛋白1基因的cDNA序列,命名为htPR-1和hyPR-1。(1)htPR-1和hyPR-1基因全长都是522bp,不含内含子,不同的是htPR-1和hyPR-1 cDNA序列有12个位点碱基发生了突变,导致其中编码的7个氨基酸不同,即发生了非同义突变。但是最终都是编码了173个氨基酸,这说明碱基位点的突变并没有导致翻译的提前终止。(2)生物信息学分析表明,与拟南芥及烟草PR-1相似,htPR-1和hyPR-1都具有SCP-PR-1-like保守结构域,N-端都具有一个26个氨基酸序列的信号肽,亚细胞定位预测分析其是一种分泌蛋白。不同的是,htPR-1二级结构预测具有5个α-螺旋结构和3个β-折叠结构,hyPR-1二级结构预测则具有5个α-螺旋结构和4个β-折叠结构,这表明htPR-1和hyPR-1基因就是PR-1在猕猴桃中的同源基因。(3)通过多序列比对和构建进化树分析,发现htPR-1和hyPR-1基因与多种植物的PR-1基因具有很高的同源性,其中与番茄、马铃薯同源性较高,亲缘关系较近,聚为一类,而与玉米的亲缘关系较远。(4)实时荧光定量PCR分析结果显示,在受到病原菌Psa侵染后,PR-1基因在‘华特’和‘红阳’中都被显著诱导,但是其在‘华特’中的表达量要显著高于‘红阳’(5倍),这表明PR-1基因可能参与了猕猴桃响应Psa侵染的免疫应答反应。(5)亚细胞定位实验结果表明,pCAM35s-PR-1-GFP融合蛋白的绿色荧光主要分布在细胞质和细胞膜上。(6)为了研究htPR-1和hyPR-1基因的功能,分别构建过表达载体,通过农杆菌介导的方法将htPR-1和hyPR-1基因瞬时表达到本氏烟草中,在接种Psa第14天时观察症状,结果发现htPR-1和hyPR-1基因都可以增强烟草对Psa的抗性。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.634.1
【图文】：

感染细菌,症状,嫩枝,褐色斑

图 1.1 红阳猕猴桃感染细菌性溃疡病的症状（李黎等 2013）A-C：主干产生乳白色黏液；D：木质部变红褐色；E：叶片出现褐色斑点，病斑周围伴有黄色晕圈；F-G：花蕾、幼芽和嫩枝感病后枯萎。Fig.1.1 The symptoms of bacterial canker disease infection in Hongyang kiwifruitA-C: The trunk overflows milky white mucus; D: Reddening of the xylem; E: Leaf with brown spots surroundedby yellow halos; F-G: Buds, shoots and twigs wilting.

模型图,植物,效应因子,模型

物也进化出了相应的抗性蛋白（R 蛋白）直接或者间接的识别病原效应因导植物产生 ETI 反应，效应因子被 R 蛋白识别后，又可通过自我修饰作用释放出新的效应因子继续引发新的 ETS 反应，随后植物也继续进化出新的白来特异性识别效应因子，引起新的 ETI 反应（图 1.2）。

通路图,免疫反应,抗性相关基因,转录组

猕猴桃应答溃疡病菌侵染的转录组研究及抗性相关基因挖掘、激活 Ca2+离子通道、促进蛋白质的翻译和次生代谢产物的产生等，植物产生免疫应答反应（图 1.3）。

【参考文献】