小麦抗条锈病基因Yr10功能结构域的初步探究

发布时间：2020-08-25 13:40

【摘要】：小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的重要的小麦病害,在全球小麦产区普遍流行,给小麦的生产带来重大的损失。小麦条锈菌是一种活体寄生真菌,也是一种转主寄生菌,在小麦上进行无性繁殖,产生夏孢子、冬孢子和担孢子,在转主寄主小檗上进行有性生殖,产生性孢子和锈孢子。小麦条锈菌还有众多的具有不同致病力的生理小种,条锈菌生理小种很容易发生毒性变异,这导致抗病小麦品种抗性“丧失”现象时有发生。因此,小麦抗锈育种是一项长期且艰巨的工作,含有抗条锈病基因的抗源材料的发掘,抗条锈病基因的染色体定位以及克隆是小麦抗锈育种的关键。目前,大约有80个抗条锈病基因位点被正式命名,但只有6个抗条锈病被克隆出来。抗条锈病基因Yr10来源于普通小麦“Moro”,是一个全生育期小种特异性抗病基因,在我国大部分地区,Yr10对大多数的当地流行的条锈菌生理小种还具有抗性。因此,Yr10抗病基因在抗病育种中还具有重要利用价值。Yr10编码一个典型的CC-NB-LRR抗病蛋白,但对其功能的研究还未见报道。因此,开展对其功能的研究很有必要,通过对其功能的研究可以明确其发挥抗病的分子机制,为Yr10在今后抗病育种中的合理利用提供理论依据。本研究在Yr10的前期研究基础上展开,我们通过分析发现,目前克隆的Yr10抗病基因并不完整,并最终克隆获得Yr10基因全长,在此基础上对Yr10的功能结构域进行了初步研究。主要研究结果如下:1.通过分析发现目前克隆的Yr10序列(AF149112)并不完整,并最终克隆到一条包含四个外显子和三个内含子的新的Yr10基因序列。新的Yr10编码区全长为2541bp,编码846 aa,命名为Yr10-1;另外还获得了一条缺失了8 bp碱基的序列,编码区全长2604 bp,编码867 aa,命名为Yr10-2,二者编码蛋白Yr10-1和Yr10-2仅在C-端末尾部分存在差异。Yr10-1是一个典型的CC-NBS-LRR类抗病蛋白,分子量大小约95.8 kDa,理论等电点为6.82,是一个亲水性蛋白。Yr10-1的生物信息学预测显示其无跨膜结构和信号肽,定位于细胞质,参与抗病反应和响应水杨酸信号,具有结合ADP/ATP的功能。系统发育树分析显示Yr10-1与乌拉尔图小麦(Triticum urartu)中的抗病蛋白的TuRPM1亲缘关系相近。2.通过农杆菌介导的瞬时表达体系在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达Yr10-1与GFP的融合蛋白,发现其定位于细胞质,并且能诱导烟草产生细胞坏死(cell death),而改变Yr10-1的亚细胞定位使其定位于细胞核时不能诱导烟草产生细胞坏死。同样的,通过农杆菌介导的瞬时表达体系在小麦AvS中表达定位于细胞质的Yr10-1后也能诱导产生细胞坏死,使其对条锈菌CYR32的抗性增强,孢子量减少。上述结果表明,Yr10-1需要定位于细胞质才能诱导产生细胞坏死和发挥抗病作用。3.通过对Yr10-1功能结构域的研究,我们证明了Yr10-1中诱导产生细胞坏死的关键结构域是N-端的CC结构域,核心区域位于1-116之间。CC结构域在烟草中表达后能诱导产生H_2O_2,其保守的“EDVID”基序在CC结构域诱导产生细胞坏死中具有重要的作用。并且证明了CC结构域只有定位于细胞质时才能诱导产生细胞坏死,与Yr10-1全长诱导产生细胞坏死的定位相同。通过免疫共沉淀和双分子荧光互补技术证明了CC结构域自身之间可以发生相互作用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.121.42
【图文】：

示意图,多倍体,谱系,世代

1 小麦多倍体基因组进化历史和各世代谱系关系示意图（IWGSC 2014）。进化时Marcussen (2014) 等人的估计，mya（million years ago, 百万年前）。-1 Schematic diagram of the relationships between wheat genomes with polyploidizatiealogy (IWGSC 2014). Time estimates are from Marcussen et al.(2014). mya, million 麦条锈病麦条锈菌分类学地位麦条锈病的病原菌是条锈菌，正式中文名称为条形柄锈菌小麦专化型（is f. sp. tritici）。条锈菌属于真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycodiniomycetes）、锈菌目（Uredinales）、柄锈菌科（Pucciniaceae）、柄锈菌属（峰 2010）。条锈菌种内可区分为不同的变种（variety）和专化型（forma s现了两种变种即原变种（P. striiformis West. Var. striiformis）和鸭茅is West. Var. dactylidis Manners）。原变种内有 6 个专化型，其中主要属大部分物种的称为条锈菌小麦专化型（商鸿生 2008）15-16。条锈菌

小麦条锈菌,生活史,孢子

第一章文献综述1.2.2 小麦条锈菌的生活史及侵染规律小麦条锈菌生活史中能产生 5 种不同类型的孢子，具有转主寄生（heteroecism）现象。小麦条锈菌在主要寄主（primary host）小麦上进行无性繁殖，产生夏孢子（Urediospore）、冬孢子（Teliospore）和担孢子（Basidiospore），在转主寄主（alternahost）上进行有性生殖，产生性孢子（Pycniospore）和锈孢子（Aceiopore）（图 1-2）（Zhenet al. 2013）。

模型图,病原体,互作,植物

图 1-3 植物与病原体互作的“ZigZag”模型(Jones et al. 2006)。Figure 1-3 “ZigZag” model of plant and pathogens interaction (Jones et al. 2006).1.4.2 植物抗病蛋白的抗病机制自 1992 年第一个抗病基因-玉米的抗圆斑病基因 Hm1 被克隆开始(Johal et al. 1992)，不断的有新的抗病基因被克隆出来。Kourelis 等（2018）统计了截止 2017 年被鉴定的314 个抗病（R）基因，他们根据这 314 个 R 基因中已知抗病机制的 128 个基因总结出了当前 R 基因存在的九种抗病机制。他们并没有根据病原菌和植物互作过程中的防卫反应 PTI 和 ETI 对抗病机制进行划分，而是根据胞外和胞内两种对病原体识别的机制进行了抗病机制的分类。这九种抗病机制（如图 1-4）大体可分为：（I）感知（perception）和（II）丧失感病性（loss of susceptibility）两种。基于感知的分子机制又可大致分为三个亚类：（Ia）类受体蛋白/激酶（receptor-like proteins/kinases, RLPs/RLKs），（Ib）类核苷酸结合的寡聚结构域（nucleotide-binding and oligomerization domain, NOD）识别受体(Nod-like receptors, NLRs)，（Ic）执行基因（Executor genes）。对于前两种，RLPs/RLKs可以直接或间接识别 PAMPs（1 和 2）；NLRs 也可分为直接或间接识别（3 和 4），以

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