苹果树腐烂病菌效应蛋白VmPxE1功能研究与互作靶标鉴定

发布时间：2020-08-25 16:00

【摘要】：苹果树腐烂病菌(Valsa mali)是一种死体营养型病原真菌。该病菌造成的苹果树腐烂病给苹果的产量和品质造成了严重的损失。目前对苹果树腐烂病菌的研究虽然很多,但关键致病因子仍然不清晰。在分子水平研究苹果树腐烂病菌的致病机理,将为进一步了解该病害提供理论依据。效应蛋白在真菌致病过程中起着至关重要的作用。基于苹果树腐烂病菌基因组测序的基础,从32个效应基因中筛选得到细胞死亡抑制子VmPxE1并对其进行功能研究和靶标筛选主要实验结果如下:1.VmPxE1的鉴定与功能解析通过农杆菌介导的PVX瞬时表达系统鉴定出苹果树腐烂病菌效应蛋白VmPxE1可以抑制由Bax引起的细胞坏死;由酵母分泌系统验证苹果树腐烂病菌效应蛋白VmPxE1的信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现基因VmPxE1在苹果树腐烂病菌侵染苹果枝条的不同时期均上调表达;进一步对苹果树腐烂病菌VmPxE1进行基因敲除,敲除后的突变体在PDA培养基中的营养生长和产孢能力与野生型相比并没有差别,但是在苹果“富士”枝条和叶片中致病力与野生型相比均显著降低;对VmPxE1进行基因回复,回复突变体的致病力回复到野生型水,这些结果表明了VmPxE1在苹果树腐烂病菌的侵染过程中起着至关重要的作用。2.VmPxE1的靶标鉴定利用酵母双杂交系统筛选得到了一个候选靶标苹果的过氧化物酶MdAPX1,经过全长验证、双分子荧光互补(BIFC)、免疫共沉淀(CO-IP)试验证均实效应蛋白VmPxE1与MdAPX1是互作的;MdAPX1系统发育分析得知MdAPX1是一种L-抗坏血酸过氧化物酶。本研究对效应蛋白VmPxE1进行了功能研究以及与寄主互作靶标筛选等实验,找到了一个互作靶标,为苹果树与苹果树腐烂病菌分子互作研究提供了重要的依据,并且为以后的致病机制的解析奠定了理论基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.611.11
【图文】：

模型图,模型,营养型,效应

图 1-1 ZIGZAG 模型（JonesAnd Dangl Nature，2006）Fig. 1-1 ZIGZAG modle （Jones And Dangl Nature, 2006）1.2.2 效应蛋白的定义为了成功侵染植物，病原菌分泌的效应蛋白进入寄主植物并破坏它们的免疫反应。虽然效应蛋白的统一定义仍然难以捉摸，但是已经鉴定出越来越多具有典型效应特征的微生物相关分子，例如小RNA和其他小分泌分子(Lo Presti et al. 2015; Rovenich et al2014; Wang et al. 2016)。狭义上而言，效应蛋白就是被某些分泌的蛋白质，通常被定义为含有不超过300个富含半胱氨酸残基的氨基酸的小分子分泌蛋白质，通过二硫键稳定其三级结构，可导致病原菌进一步在植物体内侵染和定殖(Duplessis et al. 2011; Mulleret al. 2008; Stergiopoulos et al. 2012)。1.2.3 真菌效应蛋白的研究真菌病原菌有不同的生活方式，包括死体营养型(necrotrophic)、活体营养型（biotrophic）和半活体营养型（hemibiotrophic）（Hurley et al. 2014）。死体营养型病原真菌通过快速杀死寄主细胞并在其内容物上存活（Stone 2001）。番茄织球壳菌萎蔫

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图 2-1 敲除片段构建示意图Fig. 2-1 Gene replacement strategy for effector gene以Double-joint PCR法构建敲除片段（图2-1），参考Yu的方法(Yu et al. 2004），分为四步：（1）常规PCR体系扩增neo片段及基因VmPxE1上下游片段：以质粒PFL2作为模板使用引物Neo-F/R扩增neo片段。同时将野生型03-8基因组DNA作为模板，使用1F/2R、3F/4R引物扩增目标基因的上游片段和下游片段，胶回收目标条带。（2）Double-joint PCR扩增第一步：把上游片段与下游片段以及neo基因片段混合构建融合片段。配制反应体系如下：反应成分体积5×Buffer 5 μLdNTPs 4 μL上游片段 1 μL下游片段 1 μLneo 片段 3 μLFastpfu 酶 0.3 μLddH2O 补至 25 μLPCR扩增程序为：98℃ 5 min；98℃ 30 s；58℃ 4 min；72℃ 150 s；15个循环；72℃10 min；16℃，forever。（3）Double-joint PCR扩增第二步：以（2）中PCR产物作为反应模板，使用引物1F/4R扩增敲除片段，PCR 体系如下：反应成分体积5×Buffer 5 μL1F/4R 0.4 μL/0.4 μL

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2.3.1 VmPxE1 抑制 Bax 诱导的 PCD 反应将已经构建到PVX载体上的32个基因的重组质粒转化到农杆菌GV3101，注射到烟草内，从而瞬时表达效应基因。以eGFP为阴性对照，具体的注射方法如图2-2A所示，在注射完eGFP和效应基因后16 h时，再次在同一位置注射含有BAX的农杆菌菌液。5天后观察BAX诱导的PCD反应，以明确候选基因是否具有抑制BAX诱导的PCD的功能。最终筛选得到一个能够抑制BAX诱导的PCD。如图所示注射含有BAX的农杆菌菌液的位置，出现了坏死；注射eGFP不能引起坏死；VmPxE1不能引起细胞坏死，但是能抑制BAX诱导的PCD反应，且抑制效率达到了92%（46/50）；接着由RT-PCR实验，以本氏烟基因GAPDH为内参基因

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