内蒙古中部地区粘细菌分离及其抑制马铃薯晚疫病菌的活性和成分研究

发布时间：2020-08-29 09:01

　　粘细菌(Myxobacteria)是一类具有社会性行为的高等原核生物,具有复杂的多细胞行为和形态发生,在细胞分化、发育以及生物进化研究中占有重要的地位。其代谢产物具有丰富、多样、新颖的生物活性,是筛选天然药物的良好资源,具有很大的研究开发应用价值。马铃薯是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物,也是我国的第四主粮。我国是世界上马铃薯第一生产大国,在云贵、华北、东北等气候相对较凉的地区种植。马铃薯最为严重的病害为晚疫病(Potato Late Bright),其病原菌为致病疫霉(Phytophthora infestans)。P.infestans主要侵害叶、茎和薯块,是一种能够导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的毁灭性病害。因此,研发高效无害的防治马铃薯晚疫病的农药迫在眉睫。本研究从位于内蒙古自治区的中部地区共采集139份土壤样品,并对土样的含水量、pH、有机质、速效钾、水解氮、有效磷等参数进行了测定。结果显示,内蒙古中部地区的土样基本为中性偏碱性,且土样的含水量很低,土壤肥力状况普遍较差。采用兔粪诱导、大肠杆菌划线诱导以及滤纸诱导三种方法对139份土壤样品中的粘细菌进行分离,通过将直接挑取子实体、抗生素处理以及二次诱导等多种方法相结合进行纯化,发现内蒙古中部地区的粘细菌优势种属包括6个属,分别为Myxococcus、Corallococcus、Pyxidicoccus、Cystobacter、Archangium、Melittangium。内蒙古中部包头地区的粘细菌资源最为丰富,乌兰察布地区的粘细菌资源丰富度较差。草地与耕地样品中粘细菌的种群较为丰富,而林地与未利用土地样品的种群较少。潮土、灰褐土、栗钙土和沼泽土的粘细菌表现出了较丰富的多样性,而风沙土、碱土、粗骨土与栗褐土样品中粘细菌的丰富度较差。通过分析粘细菌的分布与环境参数之间的相关性可知土壤样品的环境参数与粘细菌的分布并未表现出显著的相关性,可能是由于目前分离到的菌株数不能代表土样中的实际菌株数或者是由其他未检测的环境因子的影响所造成的。以马铃薯晚疫病致病菌致病疫霉HQK8-3为供试病菌,采用平板对峙培养法对已纯化的粘细菌菌株拮抗致病疫霉菌的活性进行检测。结果显示内蒙古中部地区83%的粘细菌菌株具有抗致病疫霉活性,其中Myxococcus和Corallococcus属的抗病菌株比例较高,Cystobacter和Melittangium属的抗病菌株比例居中,Pyxidicoccus和Archangium属的抗病菌株比例较低。菌株B25-I-1、B25-I-3与X6-II-1对致病疫霉的拮抗活性较为显著。通过结合形态特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列,进一步确定菌株B25-I-1为黄色粘球菌(Myxococcus xanthus);B25-I-3为橙色粘球菌(Myxococcus fulvus);X6-II-1为叶柄粘球菌(Myxococcus stipitatus)。抗细菌与抗真菌活性表明,菌株B25-I-1与B25-I-3可以杀死和溶解大肠杆菌(Escherichia coli),并对枯草芽孢杆菌(Bcicius subtilis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solanikuhn)、向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)均表现出了不同程度的抑制作用,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)却并未表现出抑制活性;菌株X6-II-1也可以杀死和溶解大肠杆菌,并对枯草芽孢杆菌和尖孢镰刀菌表现出了抑制作用,对其它指示菌并未表现出抑制活性。促生能力的检测结果表明,菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1在产氨、解磷、产脲酶、产吲哚乙酸、产氢氰酸和产几丁质酶等方面均未表现出促生作用,但却都显示出产铁载体的能力。采用称重法分别测定了粘细菌菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1的生长曲线,发现菌株B25-I-1在接种第6天时,菌体重量达到最大值;菌株B25-I-3在接种第7天达到菌体重量的最大值;菌株X6-II-1在接种第7天时,菌体重量达到最大。采用滤纸片法对菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1产生的抑制致病疫霉菌丝生长的活性物质的分布进行检测。结果显示,菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1产生的拮抗马铃薯晚疫病菌活性物质分布于胞外。通过单因素分析与正交优化相结合的方法对三株菌的发酵参数进行了研究。结果显示,菌株B25-I-1的最适发酵条件为:温度32℃、时间8 d,接种量10%;菌株B25-I-3的最适发酵条件为:温度30℃、时间7 d,接种量10%;菌株X6-II-1的最适发酵条件为:温度30℃、时间7 d,接种量10%。以马铃薯晚疫病致病菌致病疫霉HQK8-3为供试病菌,采用滤纸片法对菌株B25-I-1与B25-I-3的发酵浓缩液中的抑制致病疫霉菌丝生长的活性物质的稳定性进行检测。结果显示菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质对温度有着极强的耐受性,还耐受蛋白酶K的处理以及紫外光照射和自然光照射,且易于在低温条件下长期保存。活性物质抗细菌与抗真菌活性表明,菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的具有抑制致病疫霉菌丝生长活性的次级代谢产物对细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和真菌酿酒酵母菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、向日葵核盘菌均表现出了不同程度的拮抗作用。通过研究菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质对致病疫霉的生防机制,发现两株菌发酵产生的活性物质对致病疫霉的无性生殖和有性生殖都具有较强的抑制作用,此外还可降低致病疫霉菌体可溶性蛋白的含量和菌体保护酶(PPO、POD、PAL、SOD)的活性,增加细胞膜的氧化损伤与通透性,这些可能就是菌株B25-I-1与B25-I-3活性物质对致病疫霉的生防机制。对菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质对马铃薯离体叶片的防病作用进行检测,结果显示菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质均具有明显抑制致病疫霉侵染马铃薯叶片的活性且对不同品种的马铃薯叶片无损伤作用。菌株B25-I-1与B25-I-3发酵产生的活性物质经TLC与HPLC等初步分离后,将具有抗致病疫霉活性的组分进行HPLC-MS检测,发现菌株B25-I-1与B25-I-3对致病疫霉的拮抗组分中均含有Methyl(2R)-2-azido-3-hydroxyl-2-methylpropanoate与N-(3-Amino-2-hydroxypropyl)-N-meth-ylsulfuric diamide两种物质。本研究为首次对内蒙古中部地区粘细菌资源的多样性进行研究,并在此基础上筛选对致病疫霉生长具有显著抗性的菌株,并对其抗马铃薯晚疫病菌活性进行了分析,该工作的完成可能为丰富我国粘细菌资源以及研发源于粘细菌资源的抗马铃薯晚疫病等植物疫病的生物农药提供基础数据。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.32
【部分图文】：

粘细菌,时间线

图 1 粘细菌研究的时间线Fig.1 Timeline of myxobacteria research 粘细菌的分布粘细菌的分布十分广泛，在土壤、沙漠和湖水中都有发现，有时也可以在片表面被发现[18]，但是粘细菌会优先选择长在原生的土壤中、或者是富含有机质的土壤中[19]，一般喜好生活在温暖干燥的中性环境，最适pH通常为，其中,嗜纤维素的粘细菌生活环境的最适pH略低，一般为5.8～6.4。但近年

粘细菌,全球分布

虽然研究表明在温暖的半干旱地区发现的粘细菌丰富度最高，但在极端环境中也有粘细菌的存在。下图2展示了基于部分宏基因组数据的粘细菌的全球分布图。粘细菌的分布与采样的范围有着密切的关系，其中，取自欧洲以及美国的数据相对比较多，而来自亚

粘细菌,溶纤

注：*表示部分粘细菌新的科属尚无对应的中文名称此外，根据粘细菌“食性”的不同，还可以将其简单地划分为两个生理类群，即溶纤维素类群和溶细菌类群。两者的营养方式有着显著的差异。其中，溶纤维素群粘细菌可分解纤维素[ 27 ]，目前已确认的只有一个属一个种，即纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)；而溶细菌群粘细菌能高效率地分解酵母、大肠杆菌等微生物的整个细胞和各种成分，包括粘球菌属(Myxococcus)、孢囊杆菌属(Cystobacter)、珊瑚球菌属(Corallococcus)等其余 19 个属。

【参考文献】