马铃薯3个青枯菌效应蛋白功能研究

发布时间:2020-09-07 13:02
   由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病造成了世界范围内马铃薯产量的降低。大多数细菌病原体通过分泌效应蛋白到植物细胞内来操控植物免疫应答反应。由于效应子是青枯病的重要致病因子,本课题旨在通过研究效应子的基础功能继而探究马铃薯青枯病致病机理。本课题以马铃薯E3试管薯为受体,通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化技术获得了效应子Rip5、Rip6和Rip13的转基因株系。探究效应子转入所影响的马铃薯免疫途径,同时对效应子转基因株系进行了接种鉴定。并且对Rip6转基因株系进行了转录组测序,通过数据分析找到了与植物抗性有关的差异表达基因。由于Rip5毒力较强且在本氏烟叶片瞬时表达可以引起强烈的HR反应,为了深入研究Rip5的基因功能,酵母杂交实验初步筛选了Rip5的候选互作蛋白,通过免疫共沉淀实验确认了互作蛋白。以上结果为进一步研究效应子调控马铃薯免疫应答机制奠定了良好基础。主要结果如下:1.课题通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系获得了Rip5、Rip6和Rip13转基因株系。最终获得Rip5、Rip6和Rip13生根株系分别为9、13和30个。通过阳性检测,我们选取Rip5的转基因株系4、5和7;Rip6的转基因株系1、3、8和11;以及Rip13的转基因株系11、14和25进行后续试验。2.对Rip5、Rip6和Rip13转基因株系进行优势菌株UW551接种鉴定。3个效应子转基因株系接种表型与对照E3相比抗性明显下降,说明效应子Rip5、Rip6和Rip13可以促进青枯菌侵染寄主植物,降低植物抗性。3.对转基因株系PTI免疫途径标志基因进行表达量检测,发现虽然转基因株系接种抗性下降,但是PTI免疫途径并未受到影响,说明效应子基因的转入可能影响了其他免疫途径。4.对效应子Rip6转基因株系的转录组数据进行分析,发现有大量钙调蛋白、部分热激蛋白和WRKY转录因子与对照相比差异表达。推测转基因株系青枯菌抗性下降与这些基因的差异表达紧密相关。5.利用酵母杂交实验初步筛选出Rip5的候选互作蛋白,在本氏烟叶片上对Rip5及互作蛋白进行农杆菌共注射瞬时表达,通过免疫共沉淀实验进行植物体内互作验证。
【学位单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:S435.32
【部分图文】:

基因组DNA,菌株,条带


23W551菌株基因组DNA中扩增 Rip5、Rip6 和 R,条带大小为 480 bp;泳道 2、3 对应的是 Rip6 条带道 4 对应的是 Rip5 条带,条带大小为 840 bp。p6 and Rip13 amplified from genome DNAof Uip13 band, Rip13 is 480 bp; Lane 2,3 corresponds to the RLane 4 corresponds to the Rip5 band, Rip5 is 840 bp.

芽再生,马铃薯,抗性


2 超量稳定表达载体的构建将以 UW551 基因组 DNA 为模板扩增的效应子片段通过同源重组连接到表达载体 pH7C-HA 载体上,构建成 pH7C-Rip5、pH7C-Rip6 和 pH7C-Rip1表达载体,送测序验证载体构建正确。3 转基因株系的获得将构建成功的 pH7C-Rip5, pH7C-Rip6 和 pH7C-HA-Rip13 载体质粒电击转农杆菌感受态 LBA4404,以马铃薯品种 E3 的试管薯切片为外植体进行转获得的抗性芽在含有潮霉素的抗性培养基上进行生根筛选,生根良好的株行后续阳性检测,其中 Rip5、Rip6 和 Rip13 分别获得 9 个、13 个和 30 个植株。

株系,转基因,效应,字表


图 6 效应子转基因株系 PCR 检测泳道 M:Trans 2k DNA 标记;E3 为阴性对照;各图中数字表示效应子不同的转基因株系编号。A 代表效应子 Rip5 条带,B 代表效应子 Rip6 条带,C 代表效应子 Rip13 条带。用效应子 Rip5, Rip6 和 Rip13 特异引物 PCR 扩增检测转基因植株Fig. 6 PCR analysis of the effectors transgenicplantsLane M: Trans 2k DNAmaker; E3 negative control; Number stand for effectors different transgeniclines. Ais forRip5 band, B is for Rip6 band, C is for Rip13 band. PCR analysis of OE-effector lines by effector primer pair.3.1.4.2 转录水平检测由于效应子是外源基因,所以采用半定量 PCR 进行表达量检测,阳性转基因株系提取 RNA,反转录成 cDNA 后,进行表达量检测,以 Actin 为内参基因,先用 PCR 反应在低循环数下将各样品的 cDNA 浓度调成基本一致。然后使用

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