马铃薯3个青枯菌效应蛋白功能研究
【学位单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:S435.32
【部分图文】:
23W551菌株基因组DNA中扩增 Rip5、Rip6 和 R,条带大小为 480 bp;泳道 2、3 对应的是 Rip6 条带道 4 对应的是 Rip5 条带,条带大小为 840 bp。p6 and Rip13 amplified from genome DNAof Uip13 band, Rip13 is 480 bp; Lane 2,3 corresponds to the RLane 4 corresponds to the Rip5 band, Rip5 is 840 bp.
2 超量稳定表达载体的构建将以 UW551 基因组 DNA 为模板扩增的效应子片段通过同源重组连接到表达载体 pH7C-HA 载体上,构建成 pH7C-Rip5、pH7C-Rip6 和 pH7C-Rip1表达载体,送测序验证载体构建正确。3 转基因株系的获得将构建成功的 pH7C-Rip5, pH7C-Rip6 和 pH7C-HA-Rip13 载体质粒电击转农杆菌感受态 LBA4404,以马铃薯品种 E3 的试管薯切片为外植体进行转获得的抗性芽在含有潮霉素的抗性培养基上进行生根筛选,生根良好的株行后续阳性检测,其中 Rip5、Rip6 和 Rip13 分别获得 9 个、13 个和 30 个植株。
图 6 效应子转基因株系 PCR 检测泳道 M:Trans 2k DNA 标记;E3 为阴性对照;各图中数字表示效应子不同的转基因株系编号。A 代表效应子 Rip5 条带,B 代表效应子 Rip6 条带,C 代表效应子 Rip13 条带。用效应子 Rip5, Rip6 和 Rip13 特异引物 PCR 扩增检测转基因植株Fig. 6 PCR analysis of the effectors transgenicplantsLane M: Trans 2k DNAmaker; E3 negative control; Number stand for effectors different transgeniclines. Ais forRip5 band, B is for Rip6 band, C is for Rip13 band. PCR analysis of OE-effector lines by effector primer pair.3.1.4.2 转录水平检测由于效应子是外源基因,所以采用半定量 PCR 进行表达量检测,阳性转基因株系提取 RNA,反转录成 cDNA 后,进行表达量检测,以 Actin 为内参基因,先用 PCR 反应在低循环数下将各样品的 cDNA 浓度调成基本一致。然后使用
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