小西葫芦黄花叶病毒遗传多样性及致病力分析

发布时间：2020-09-08 07:20

　　小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus),是侵染葫芦科作物的主要病毒之一,可引起严重花叶、皱缩、果实畸形等症状,给葫芦科作物的生产造成极为严重的损失。建立准确的ZYMV检测体系和种植抗病品种是目前最为有效的防治措施。本研究制备了ZYMV外壳蛋白特异性抗血清,分析了危害山东葫芦科作物的ZYMV分离物的分类地位,构建了ZYMV侵染性克隆并研究了HCpro WxxxG基序在ZYMV致病过程中的作用,筛选了抗ZYMV的葫芦科作物品种,为有效防治ZYMV提供了基础。主要研究结果如下:(1)ZYMV CP特异性多克隆抗体的制备及应用。利用ZYMV特异性引物扩增CP基因编码序列,并克隆到原核表达载体pEHISTEV上。通过对宿主菌种类、IPTG诱导时间及浓度等因素进行筛选,获得最佳表达条件:Rosetta菌株,利用0.2 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h。通过原核表达方法成功诱导表达出37 kDa左右的融合蛋白,将融合蛋白免疫健康新西兰长耳兔获得效价为1:32768的ZYMV CP特异性抗血清。与RT-PCR对比发现,制备的抗血清具有高度的准确性。利用该抗血清对西葫芦(绿源冬宝)和甜瓜(火银瓜)种子检测发现,种子带毒率分别为39.8%、15.1%,幼苗带毒率为2.56%和5.13%,对种子进行热处理可有效降低幼苗带毒率。(2)ZYMV两个山东分离物(CN:Cm:17、CN:Lc:17)全基因组序列的克隆及分析。在山东泰安采集到的有明显黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到ZYMV,利用RT-PCR和5′末端序列扩增技术(RACE)获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(南瓜分离物)和CN:Lc:17(丝瓜分离物)。序列分析结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外分别含有9,593和9,591个核苷酸(Nucleotides,nt),编码一个含3 080氨基酸的多聚蛋白。在多聚蛋白氨基酸水平上,CN:Cm:17与CN:Lc:17一致率为96.7%,与NCBI数据库中48个ZYMV分离物一致率分别为90.3%~97.8%、90.5%~98.4%。重组分析发现,CN:Lc:17分离物内具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17两个分离物的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,中国分离物分别聚集在A-V和A-VI亚组。(3)ZYMV CN:Cm:17分离物全长侵染性cDNA克隆的构建。利用同源重组的方法将CN:Cm:17全基因组克隆到含35S启动子的农杆菌双元载体pCam35S上,命名为pCamZYMV。将含有pCamZYMV的利用农杆菌浸润接种到西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)等寄主上,接种14天后表现与野生型ZYMV类似症状,侵染效率为100%,表明构建的pCamZYMV具有较好的侵染性。将带绿色荧光蛋白gfp基因序列插入到pCamZYMV侵染性克隆NIb和CP之间,获得pCamZYMV-GFP。将其通过农杆菌浸润方法接种西葫芦、南瓜,5天后接种叶上可观察到绿色荧光,14天后系统叶片表现花叶症状,并在发病部位观察到明显绿色荧光。(4)WxxxG保守基序影响ZYMV致病力并参与HCpro抑制RNA沉默功能。在pCamZYMV-GFP侵染性克隆的HCpro编码区域WxxxG基序保守位点引入突变,获得单突变体W207A、G211A及双突变体WG。将突变体接种至西葫芦品种绿源冬宝发现,突变W_(207)位点或WG位点均减轻症状,显著降低病毒积累水平;突变G_(211)位点对病毒症状和积累水平无明显影响。RNA沉默试验分析发现,突变W_(207)位点对HCpro抑制RNA沉默能力无明显影响,但突变G_(211)位点能够显著降低ZYMV HCpro抑制RNA沉默能力。(5)40个葫芦科品种对ZYMV的抗性鉴定。结果发现,精选唐山秋瓜和青丰长瓠子瓜为高抗品种;雪峰小玉五号和金福为抗病品种;津研四号、中农28号、耐热王中王、泰国中绿丝瓜、蟋蟀牌肉多多、高抗巨龙、盈克二号、浙蒲6号和佳丽蒲瓜9个为中抗品种。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S432.41
【部分图文】：

西葫芦,症状,果实

目前已报道至少能够侵染葫芦科（Cuc（Asteraceae）等 11 个科的植物(唐超等，201科作物后可产生严重的病毒病症状，致使果实颜至不结果，给农户造成一定的经济损失。不同敏严重程度有差别，并且同一作物在不同生长条件叶片表现为脉明，后期老叶出现褪绿黄化、花叶等症状，果实局部膨大或颜色分布不均(彭斌等、花叶，后期表现为明显泡状斑纹(陈远超 2014西瓜果实上呈现颜色不均匀的症状以及不同程度缩、畸形症状，特别的是叶缘呈锯齿状，果实裂芽率低(Leoq and Pitrat 1984; 朱英芝 2012)。

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译成一个多聚蛋白，被自身编码的三个蛋白酶 P1、HCpro 和 NIa 切割成一和第二蛋白酶（P1 和 HCpro）分别在 EVDHS/S 和 YRVG/G 位点之间割（图 1-2）。NIa 以反式切割的方式切割 P3、CI、VPg、CP 四个蛋白（两端进行自身催化裂解。另外，在 P3 编码区域病毒通过 RNA 转录滑动或码一个新蛋白 P3N-PIPO(Chungetal.,2008)。ZYMV 两端的非编码区域对必需的，不同 ZYMV 分离物之间的非编码区域序列存在较大差异。非编含 A、U 碱基（69％），与病毒基因组连接蛋白（VPg）共价连接，3′为 polOn2007)。RNA 病毒基因组较小，为了应对其结构限制同时尽量减少病毒的影响以及抵抗宿主的防御机制等，它们会利用各种策略来编码或招募所以保证其侵染性。其中一种策略是依赖具有多功能的病毒蛋白的表达(VWeber and Bujarski 2015)。ZYMV 基因组编码的蛋白大多具有多种功能，集中在 CP 和 HCpro 上，以下将针对这两个蛋白进行介绍。

基序,马铃薯Y病毒属,功能图,氨基酸

小西葫芦黄花叶病毒遗传多样性及致病力分析DN 中“D”对导致症状表达起到关键性作用，突变基序中的 D 为 G 丧坏死能力(Huetal.,2009)。ZYMVHCpro 中 CDN 突变为 CYN 后减轻但对于 HCpro 自身 RNA 沉默抑制活性无影响，但其参与 ZYMV 症尚不清楚(Desbiez et al., 2010)。 C 端是最保守区域（氨基酸 301-456），具有半胱氨酸型蛋白酶活性 C 末端进行自切割。C 端的 PTK 基序 N 端的 KLSC 基序共同参与人提出 ZYMV HCpro 参与蚜虫传播的分子机制可分为两种不同的相梁假说”：一种是通过 PTK 基序与 CP N 末端的 DAG 基序直接相互的结合(Peng et al., 1998)，另一种是 KLSC 基序与蚜虫口针之间的相, 1998)，Dombrovsky 等（2005）利用 TuMV CP 的 N 端替换 ZYMV 重组嵌合体证实了这一说法(Dombrovsky et al., 2005)。

【参考文献】