苏云金芽胞杆菌CwlC互作蛋白筛选及YhcZ功能初探

发布时间：2020-09-07 17:57

　　 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuirigienss,Bt)为革兰氏阳性细菌,其在芽胞形成的同时能够产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),对多种鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫具有特异性杀虫活性。Bt因其广泛的杀虫谱和对环境友好等特点,成为目前农业上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂。但在田间实际应用过程中,Bt制剂面临持效期短的问题,主要原因为杀虫晶体蛋白在紫外线的照射下容易失活。已有研究表明细胞壁包裹晶体能够有效地延长晶体蛋白对害虫防治的持效期。前期研究发现了一个调控Bt母细胞裂解的关键性肽聚糖水解酶CwlC,其缺失后完全阻断了母细胞的裂解,且不影响芽胞形成、晶体蛋白产生及生物杀虫活性。本研究旨在明确CwlC分泌到胞外作用于细胞壁的降解机制以及cwlC基因的上游调控机制。主要的研究结果如下:利用“垂钓(pull-down)”方法和质谱分析,初步筛选到20个功能基因,其编码的蛋白可能与CwlC水解酶存在相互作用。通过生物信息学分析,选定pbp(基因编号为HD73_2479)和groEL(基因编号为HD73_0246)作为候选基因进行下一步研究。pbp编码青霉素结合蛋白PBP,groEL编码分子伴侣GroEL蛋白。优化大肠杆菌异源表达系统,分别纯化出PBP与GroEL蛋白。借助pull-down手段,进一步验证了 CwlC水解酶与PBP蛋白的体外互作关系;同时发现CwlC蛋白与GroEL蛋白并无互作关系。该研究结果为深入研究CwlC蛋白的分泌途径和进一步揭示Bt母细胞裂解机制奠定了基础;而且为有效解决Bt生产实际应用问题提供科学依据,为新一代Bt制剂的分子设计开辟遗传改良的新途径。通过DBTBS(http://dbtbs.hgc.jp/)在线初步预测调控cwlC基因的转录因子,并结合RNA-seq数据分析其表达水平,选定在Bt生长晚期表达的编号为HD73 5824基因进行功能分析。利用生物信息学,明确了HD73_5824基因为yhcZ基因,HD73_5825基因为yhcY基因,推测两者共同组成双组份系统。借助同源重组手段,构建了yhcZ基因的缺失突变体HD(△yhcZ),β-半乳糖苷酶活性检测发现,yhcZ基因不调控cwlC基因;通过光学显微镜观察发现,yhcZ基因缺失不影响母细胞的裂解;通过生长曲线测定发现,yhcZ基因缺失显著影响Bt菌株的生长;碳源利用实验表明,yhcZ负调控Bt对葡萄糖的利用;Biolog分析明确了yhcZ基因缺失影响Bt对其他碳源的利用。该发现明确了yhcZ基因在Bt菌株生长过程中对葡萄糖及其他碳源的利用具有重要的促进作用。本研究结果为解析YhcZ调控葡萄糖及碳源利用的分子机制奠定基础,且为进一步研究细菌生长及发酵提供参考。
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S476
【部分图文】：

图１．１邋Ｂｔ中的晶体和芽胞（杨静妮，２０１３）逡逑邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ａｎｄ邋ｓｐｏｒｅ邋ｉｎ邋Ｂｔ邋（Ｙａｎｇ邋Ｊｉｎｇｎｉ，邋２０１３的防治逡逑治森林害虫的非化学防治手段。ｖａｎ邋Ｆｒａｎｋｅ

ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ逡逑图１－２细胞壁结构和组装（Ｐａｒａｄｉｓ－Ｂｌｅａｕｅｒａ／．邋２０１０）逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋（Ｐａｒａｄｉｓ－Ｂｌｅａｕ邋ｅｌ邋ａｌ．邋２０１０）逡逑注：Ａ：细菌细胞外围细胞壁示意图邋Ｍ：邋ＴＶ－乙酰胞壁酸邋Ｇ：邋；Ｖ－乙酰葡萄糖胺逡逑Ｂ：邋ＰＧ组装概述图邋ＰＧＴ：肽聚糖糖基转移酶结构域邋ＴＰ：转肽酶结构域逡逑圆点：吸附的肽邋绿色：ＰＧ层邋灰色：多蛋白复合物紫色Ａ类ＰＢＰ逡逑

Ｆｉｇ邋１－３邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｗｌＣ邋ｇｅｎｅ邋ａｆｆｅｃｔｓ邋ｍｏｔｈｅｒ邋ｃｅｌｌ邋ｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｂｔ邋ｓｔｒａｉｎ邋（Ｃｈｅｎ邋Ｘｉａｏｍｉｎ，邋２０１７）逡逑注：ＴＶ细菌对数生长期结束，进入稳定期邋Ｔ１６：细菌生长到％后再培养１６ｈ逡逑Ｔ２４：细菌生长到Ｔ0后再培养２４ｈ逡逑１．４青霉素结合蛋白的分类及功能逡逑１９７２年Ｓｕｇｉｎａｋａ等用放射性同位素对青霉素进行标记，观察其在细菌表面的位，由此发现了可以与青霉素结合的蛋白，并将其命名为青霉素结合蛋白。ＰＢＰｓ能逡逑够催化糖链的聚合（转糖）和糖链间交联（转肽），在细菌肽聚糖的合成过程中起重逡逑

【参考文献】

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本文编号：2813654