胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种全基因组解析及致病相关基因功能研究

发布时间：2020-09-12 08:09

　　胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)是引起植物软腐病的重要病原物,寄主范围十分广泛,在世界各地均有发现,由该致病菌引起的病害给农业经济带来严重的损失。随着DNA测序技术的进步和普及,加快了基因组学的发展,为探索病原微生物的遗传规律和致病机理提供了丰富的数据和行之有效的方法。目前,对于胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense)的基因组信息及致病性调控机理鲜有报道。本研究采用DNA测序技术对胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种BZA12菌株进行了全基因组测序,并通过生物信息学的方法从基因组水平分析病原菌的致病相关基因特征,筛选出该病原菌与致病相关的候选效应蛋白基因,并初步探索其功能。取得主要结果如下:1.本研究对采自辽宁省不同地区的黄瓜和茄子细菌性软腐病样进行分离培养,并进行细菌生理生化和分子生物学鉴定及致病力测定。结果表明,在黄瓜病样中分离出的病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种,茄子病样中分离出的病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为辽宁省设施茄子生产上新发现病害。所有菌株在菌落形态上无明显差异。生理生化分析表明,两种病原物在α-甲基葡萄糖苷的利用,对麦芽糖产酸,蔗糖还原能力和D-山梨醇利用上存在差异。分子生物学分析表明,黄瓜上分离的菌株在Pcb特异性引物的扩增下可以产生320bp的条带,而茄子上分离的菌株不能,但在Pcc特异性引物的扩增下可以产生550bp的条带。ITS-RFLP引物扩增及基于16Sr DNA序列构建的系统发育树分析均可将茄子和黄瓜上分离的菌株区分为两种不同的病原菌。致病力测定结果显示菌株编号为BZA的菌株致病力最强。2.本研究基于二代测序Hiseq 2500 Illumina和三代测序Pacbio RSII两种DNA测序技术结合的方法对Pcb BZA12菌株进行全基因组测序,对该病原菌的基因组组分,基因功能注释和比较基因组三个方面进行了系统分析。结果表明,Pcb BZA12基因组大小为4924705 bp,GC含量51.97%,含有4508个编码基因;共预测到串联重复序列192个,小卫星序列139个和微卫星序列10个;预测出非编码RNA tRNA 76个,rRNA 22个和sRNA 26个;功能注释结果表明这些基因在细胞组分、膜组分、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜转运和信号传导等功能注释的基因较多。致病相关基因分析结果显示,该病原菌共预测出细胞壁降解酶类相关基因54个,细菌Ⅰ~Ⅵ型分泌系统相关基因215个,毒素相关基因16个。比较基因组分析出胡萝卜软腐果胶杆菌三个亚种所共有的基因家族数量为3107个,Pcb BZA12,Pco BC S7和Pcc PC1特有基因家族数量分别为36,22和11个。Pcb BZA12菌株的共有基因数量为3859个,特有基因数量为649个。果胶杆菌系统进化树分析表明,Pcb BZA12菌株与另外两个Pcb菌株遗传距离最近,与其他同属不同种的菌株亲缘关系相对较远。3.本研究通过三种细菌Ⅲ型分泌效应蛋白序列预测软件来预测Pcb BZA12菌株的效应蛋白,结合基因功能注释信息,选取了五个注释为假定蛋白的候选效应蛋白,并在烟草上进行基因的亚细胞定位和过敏性坏死分析,最后对产生过敏性坏死反应的基因进行生物信息学分析。结果表明只有PCB_2483的候选效应蛋白基因能引起烟草的过敏性坏死反应,亚细胞定位仅被定位在细胞核上。生物信息学分析结果显示,PCB_2483基因与已知的Pcb SX309和Pcc PCC21菌株的基因相似度在98%左右,由305个氨基酸组成,碱性氨基酸所占比例最大,发现1个可能与之存在互作关系的蛋白,二级结构中α螺旋和无规则卷曲结构所占比例较大,是一种具有亲水性,含脂类较高的蛋白。4.本研究利用T线性化自杀载体p LP12与目的基因的上下同源臂融合基因构建了PCB_2483基因的缺失突变体菌株,同时构建了该突变菌株的功能互补菌株,并连同野生菌株一起对三个菌株的致病性,过敏性和一些生物学特性进行比较分析。结果显示,突变菌株的致病性、生长速率、游动性、生物膜的形成,与野生型和互补菌株存在一些差异。对细菌的沉降性,胞外酶的水解能力,烟草的过敏性反应方面未产生明显差异。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.31
【部分图文】：

菌落形态,茄子,茎秆,黄瓜

图 2-1 菌落形态特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony3 柯赫氏法则验证将分离得到的菌株分别重新接种到健康的黄瓜和茄子的果实、茎秆和叶片上，48后观察接菌结果显示，所有菌株均能引起寄主植物产生软腐病，其病症与田间症状一致（图 2-2）。从接种的组织中再次分离的菌株与原始菌株的生物学，分子生物性一致，确认分离的细菌菌株为致病菌。AB C

菌落形态,菌落形态

图 2-1 菌落形态特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony赫氏法则验证离得到的菌株分别重新接种到健康的黄瓜和茄子的果实、茎秆和叶片察接菌结果显示，所有菌株均能引起寄主植物产生软腐病，其病症与田（图 2-2）。从接种的组织中再次分离的菌株与原始菌株的生物学，分致，确认分离的细菌菌株为致病菌。EB CF

特异性引物,菌株,区域,病原菌

第二章胡萝卜软腐果胶杆菌的分离与鉴定分子生物学鉴定carotovorum PEL 基因设计的特异性引物 Y1/Y2 对供试菌株进示所有菌株均产生了一个 430 bp 左右的片段，可以认为这些种。然后分别用 Pcb 菌株的特异性引物 BR1f / L1 和 Pcc 菌株PCCR 进行扩增，结果显示，在黄瓜上分离的病原菌均扩增cb 菌株特异性引物扩增出的预期条带大小相符，而在茄子上 550 bp 大小的片段，与 Pcc 菌株的特异性引物预期片段相S rDNAITS 区 PCR 扩增出 550 和 580 两条主要条带，然后将黄瓜上分离的病原菌和茄子上分离的病原菌产生完全不同的M 1 2 3 4 5 6 7 8A1 2 3 4 M20B

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