饲喂竹子不同部位对圈养大熊猫肠道微生物的影响

发布时间：2020-09-19 15:26

　　大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的日常饮食中竹类食物占到99%以上,每天需摄食约12.5千克的竹子,采食时间约为14小时。但大熊猫在漫长的进化历史中,仍保留着肉食性动物的胃肠道,没有盲肠、肠道短且结构简单,食物通过速度非常快,致使食物不能充分发酵,并且竹子中的营养水平较低。在这种饮食情况下,为满足机体营养所需,大熊猫体内的肠道微生物进化并适应以竹子为主的饮食,在营养物质消化中起到重要的吸收和转运功能。目前圈养大熊猫的人工投喂受到运输、保鲜等条件的限制,会长时间、连续性的饲喂单一部位的竹子。而不同部位的竹子中营养成分差异显著,竹笋中富含更多的粗蛋白,竹茎中含更多的粗纤维,并且在饲喂竹子不同部位时,大熊猫的表观消化率也不同,因而供肠道微生物利用的营养成分呈显著性差异,肠道微生物的组成和功能也会随之产生变化。我们之前的研究发现连续饲喂单一部位的竹子给圈养大熊猫带来不利影响,但肠道微生物的组成及功能变化还不得而知。因此,本研究使用16S rRNA基因测序技术对成都大熊猫繁育研究基地的圈养大熊猫肠道微生物基因进行测序,探索连续懫食单一部位的竹笋、竹叶和竹茎时肠道微生物的组成情况,并与野外大熊猫和其他食性哺乳动物进行对比;使用宏基因组测序技术,对肠道微生物的功能进行注释,探讨不同竹类食物对大熊猫肠道微生物组成和功能的影响,以及探讨营养成分的变化与肠道微生物的关系;使用酶循环法测定圈养大熊猫血清总胆酸,进行肠道微生物在功能上与宿主能量所需关系的验证。以此给生产上对不同竹子部位食物的选择问题和繁衍生息问题提供理论基础。本论文具体分为三个实验部分:试验一、饲喂竹子不同部位对圈养大熊猫肠道微生物组成的影响为研究连续性饲喂不同部位的竹子对大熊猫肠道微生物组成的影响,进行圈养大熊猫粪便收集工作,根据采食部位的不同(竹笋、竹茎、竹叶)分为三个试验组,每组收集9个样品,且在样品收集前保持饲喂同一部位的食物20天以上。使用16S rRNA基因测序技术对三个饲喂周期的微生物基因进行测序和分析。结果表明三种不同部位竹子的投喂对圈养大熊猫肠道微生物组成的影响较大,CULM组的肠道微生物组成与其他两组具有更加显著的区别,并且与野外大熊猫和部分杂食性动物较为接近。此外,发现三个能够显著区分竹笋和竹茎的菌属,分别是链球菌属、乳球菌属和气单胞菌属,这三种微生物与特定部位竹子的饮食具有密切联系。利用PICRUSt分析发现CULM组的肠道微生物在功能上具有更强的极性氨基酸转运的能力。试验二、饲喂竹子不同部位对圈养大熊猫肠道微生物功能的影响为进一步研究圈养大熊猫在饲喂不同竹类食物下肠道微生物的功能变化,使用宏基因组基因测序和数据库注释的方法进行不同部位竹子对大熊猫肠道微生物功能的分析。根据采食部位的不同(竹笋、竹茎、竹叶)分为三个试验组,每组收集3个粪便样品,且在样品收集前保持饲喂同一部位的食物20天以上。结果发现,三组大熊猫的肠道微生物组成在种水平上发生显著变化,随之功能也发生明显的改变。相较于其他两组,CULM组肠道微生物具有更多编码纤维素酶和半纤维素酶的基因,并且编码α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶家族(GH13和CBM48)的基因丰度高于其他两组,这两个家族具有结合和降解淀粉的能力。此外,CULM组肠道微生物与其他两组相比在脂肪酸生物合成(ko00061)、胆汁酸生物合成(ko00120,ko00121)以及8种氨基酸生物合成,包括精氨酸(ko00220)、赖氨酸(ko00300)、苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸(ko00400)、缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸(ko00290)也具有更高的酶丰度;而LEAF组肠道微生物在TCA循环(ko00020)具有更高的酶丰度,并且发现产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)的传染性病原体(H00280)溶血素E(K11139)相较其他两组具有更高的丰度,可能增加肠道疾病的风险。但同时发现有两种具有解毒机制的酶在LEAF组中具有较高的酶丰度,包括具有氰化物解毒功能的氰酸盐裂解酶(EC 4.2.1.104)和具有抗菌、抗炎和抗病毒作用的溶解酵素(EC 3.2.1.17);SHOOT组肠道微生物在磷酸戊糖途径(ko00030)中涉及到的酶的总丰度以及关键酶(glucose 6 phosphate1 dehydrogenase,K00036)丰度均高于其他两组。此外,我们发现在三个采食周期下,大熊猫的肠道微生物关于能量的产生活性似乎随宿主的需求进行变化,但有待于进一步研究。试验三、饲喂竹子不同部位对圈养大熊猫血清总胆汁酸含量的影响在饲喂竹茎期间,大熊猫肠道微生物具有更高的胆汁酸生物合成效率,胆汁酸在动物机体脂肪代谢中起到关键作用。本实验在实验一和实验二的基础上,进行大熊猫血清总胆汁酸(TBA)的测定,分析大熊猫血清TBA的含量与肠道微生物胆汁酸生物合成能力的关系,进一步探讨圈养大熊猫肠道微生物功能与宿主能量代谢的关系。根据采食部位的不同分为三个试验组,进行大熊猫血液采集并分离血清,且在样品收集前保持饲喂同一部位的食物20天以上。最终SHOOT组采集9只大熊猫的血液,LEAF组采集6只大熊猫的血液,CULM组采集4只大熊猫的血液。大熊猫血清总胆酸的检测结果表明肠道微生物合成能力较强的CULM组的TBA含量最低,为肠道微生物在能量平衡上为宿主带来有利影响提供新的依据。本论文的试验结果表明大熊猫肠道微生物能够帮助宿主适应饮食的变化。并且发现圈养大熊猫在连续饲喂竹茎期间肠道微生物的组成与饲喂竹笋期和饲喂竹叶期明显不同,具有更强的消化纤维素、半纤维素和淀粉的能力,也具有更强氨基酸的生物合成能力。LEAF组微生物利用木质素能力更强,而长时间采食竹叶能够引起毒性因子丰度增加,引起肠道疾病,但在饲喂竹叶时期肠道微生物具有一定解毒机制来应对这种不利影响。总而言之,圈养大熊猫肠道微生物能够帮助宿主适应不同部位竹子饮食所带来的影响。本研究也进一步揭示了圈养大熊猫肠道微生物与食物营养成分的关系,为圈养大熊猫在日常竹子食物投喂的选择问题提供理论基础。
【学位单位】：西华师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S865.3
【部分图文】：

大熊猫的竹子部位饲喂情况

序列,操作单元,聚类,情况

2.3.1 大熊猫肠道微生物的组成结构自 2016 年 10 月至 2017 年 6 月根据竹子人工投喂情况，见图 2-1，每个采食期各收集 9 只大熊猫样品。在收集期间每只大熊猫每天补充少量熊猫窝头（0-1000g）和苹果（0-300g）。对 27 个粪便样品 16S rRNA 基因 V4 区进行测序，共得到 2,346,890 条原始数据（raw reads），在质控后，以及去除 72,155 条植物叶绿体序列（tags），共得到 2,240,560 有效序列，平均每个样品 82,984 条，聚类所有样品序列并产生 340 个 OTU，见图 2-2。所有样品序列共注释到 10 个门以及 160 个属，见图 2-3。门水平т主要由 56.24%的厚壁菌门和 43.53%的变形菌门为主，以及少量的梭杆菌门（0.18%）和其他 7 个菌门（0.05%）。在属水平т，丰度排名前十的微生物占据 83.2%的序列，其中变形菌门的埃希氏/志贺菌属（32.24%）为绝对核心菌属，其次是厚壁菌门的链球菌属（24.66%）、Clostridium sensu stricto 1（11.96%）、乳球菌属（5.32%）。

肠道微生物,样品,丰度

图 2-3 所有样品的主要肠道微生物组成Fig. 2-3 Main gut microbial composition in 27 samples如图 2-4 所示，с种п同部位竹子的投喂对圈养大熊猫肠道微生物组成的影响较大，щ CULM 组中肠道微生物的组成у其他两组有显著差异。在门水平с组微生物的组成情况见图 2-4（A），CULM 组中厚壁菌门的丰度显著高于其他两组（q 值< 0.01），LEAF 组中变形菌门的丰度显著高于其他两组（q 值< 0.01）（图 2-5），而在 SHOOT 组中两种主要菌门的比例相对平衡。在属水平т的差异见图 2-4（B），SHOOT 组中乳球菌属、气单胞菌属、Clostridium sensu stricto1、埃希氏/志贺菌属为主要菌属，щ前两者的丰度在с组中具有显著优势（q 值<0.01）；在LEAF组中埃希氏/志贺菌属明显增加，щ显著高于其他两组（q值< 0.01）；而 CULM 组中链球菌属显著高于其他两组（q 值< 0.01），显著性差异见图 2-5。此外，我们发现在叶组中大肠杆菌的丰度最高（图 2-6）。通过 α 多样性分析发

【参考文献】