番茄miR319c对灰霉病菌侵染的应答及其功能研究

发布时间：2020-09-22 16:04

　　 miR319是一种保守的miRNA,已有研究发现它参与植物的生长发育、对干旱、寒冷及盐胁迫的应答,但在真菌胁迫应答方面的研究几乎没有。本实验旨在利用生物学实验方法研究植物miR319c及其靶基因在灰霉菌侵染植物过程中的生物学功能。得到的主要实验结果总结如下:(1)RT-qPCR检测发现,miR319c在感染灰霉菌的番茄中表达下调,靶基因TCP24和TCP29的表达上调,说明miR319c可能通过调节靶基因参与番茄叶片对灰霉菌感染的响应。(2)在转基因拟南芥和转基因番茄中,miR319c得到了过量表达,相应地,其5个TCP家族成员的靶基因表达显著下降。(3)接菌实验证实,过表达miR319c的转基因拟南芥叶片和转基因番茄叶片没有明显的病斑,台盼蓝染色结果发现灰霉菌菌丝在过表达miR319c的植株相比于各自的野生型明显受到抑制,说明miR319c的过表达增强了转基因植株对灰霉菌的抗性。(4)基于过表达miR319c转基因植株表现的抗性,本研究对茉莉酸(JA)合成和信号转导相关基因、miRNA合成过程关键基因以及一些胁迫应答相关miRNA的表达进行了RT-qPCR检测。其中,JA合成和信号转导相关基因表达大多数都呈上调,可能JA响应灰霉菌的诱导从而激活下游相关防御反应;另外,实验结果显示植物响应胁迫相关miRNAs的表达受miR319c过表达的影响;miR319c的过表达或者灰霉菌的侵染对miRNA合成途径主要基因的表达没有明显的影响。(5)基于RNAi技术和过表达手段,构建了miR319靶基因TCP的RNAi载体和过表达载体,并导入拟南芥。总之,本实验成功获得了ath-miR319c过表达的转基因拟南芥和番茄植株,揭示了miR319c的过表达增强了转基因植株对灰霉菌的抗性。
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.412
【部分图文】：

浙江理工大学硕士学位论文 番茄miR319c对灰霉病菌侵染的应答及其功能研究的CT值-内参的CT 值）灰霉菌处理组（-所需检测基因的 CT 值-内参的 CT 值）对照组[66]。2.8 MiR319 过表达载体的构建和转基因植株的产生2.8.1 过表达载体的构建为了进一步研究 miR319c 在植物适应非生物胁迫或生物胁迫中发挥作用的机制，本实验构建了 miR319c 过表达载体，含有 miR319c 前体（pre-athmiR319c）的拟南芥互补 DNA（cDNA）被扩增，然后克隆到表达载体 pBIN438，产生ath-miR319c 过表达基因构建体，p35S-athmiR319c / p35S-Km。如图 1 所示，ath-premiR319c 基因处于 CaMV 35S 启动子下游。

第三章 实验结果1 灰霉菌侵染后番茄叶片的分子检测1.1 MIR319c 在灰霉菌侵染的番茄叶片表达变化先前的研究表明 miR319 与一些非生物胁迫（干旱、盐、寒冷、氮缺乏）有关，此外，本实验室之前在感染灰霉菌 7d 的番茄（金棚 1 号）叶片中进行高通量分析，研究响应灰霉菌胁迫的 sRNA，结果显示 miR319 由灰霉菌感染诱导[54]。为了研究灰霉菌侵染番茄后 miR319c 的响应模式和作用机制，本实验在感染了灰霉菌的番茄（microTom）叶片内检测 miR319c 的表达水平和表达动态（microTom 是模式植物，生长周期短，个体小，做转基因相对容易）。RT-qPCR结果表示，在感染了灰霉菌的番茄叶片内，随着侵染时间的推移，miR319c 的表达也在发生变化。本实验结果显示初级转录本的表达趋势显示上调；前体的表达趋势显示下调，miR319c 表达下调。

图 3 miR319c 在番茄中的靶基因 TCP24 和 TCP29 在感染灰霉菌的番茄叶片内的动2 过表达 MiR319c 转基因拟南芥分子分析2.1 转基因拟南芥的阳性鉴定2.1.1 Kan 基因的扩增为了筛选含有 miR319c 过表达构建体的阳性转基因植物，本实验以和转基因型的拟南芥基因组为 PCR 模板，扩增 Kan 基因并鉴定出 13 个阳因株系。如图所示，13 个 line 的基因组中均扩增出了 Kan 基因，说明过体已经在拟南芥中成功表达。图 4 野生型和转基因拟南芥叶片内 Kan 基因的扩增

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本文编号：2824612