苹果青霉病害致病菌Penicillium expansum候选效应子的系统发掘与功能分析的初步研究

发布时间：2020-09-22 17:00

　　 Penicillium expansum是苹果采后青霉病害的主要病原菌。青霉病害的发生不仅造成采后苹果巨大经济损失,而且P.expansum分泌产生的次生代谢物棒曲霉素(patulin)有致畸、致癌和免疫毒性,威胁人类健康。尽管已有不少控制苹果青霉腐烂病害的报道,但对P.expansum侵染过程和机理的研究鲜有报道。本论文主要是在宿主植物组织诱导物存在条件下,利用转录组学和分泌蛋白组学方法对P.expansum基因和分泌蛋白的表达情况进行差异分析,发掘候选致病效应子,进而探究P.expansum侵染机制,为防控苹果采后青霉腐烂病害提供新策略。研究获得的具体成果及结论如下:1、转录组(RNA-Seq)分析显示,与对照(察氏培养基)相比,宿主植物组织培养基(苹果汁)中培养的P.expansum在24 h有3786个基因、72 h有4840个基因上调表达(p≤0.05),GO注释分类显示差异基因涉及23类生物学过程(biological process,BP),15类细胞组分(cellular component,CC)和14类分子功能(molecular function,MF),富集程度较高的亚类包括细胞(cell)、结合(binding)和催化活性(catalytic activity)等。KOG功能分析,上调表达基因涉及的22类主要包括脂质运输,代谢(lipid transport and metabolism)、次级代谢产物的生物合成,转运,分解代谢(secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism)和通用功能预测(general function prediction only)等。上调表达基因信号肽扫描分析,鉴定其中的550个(24 h)和727个(72 h)为分泌蛋白的编码基因。随机挑选13个上调表达基因进行qRT-PCR验证,基因表达丰度变化与RNA-Seq分析结果基本一致。2、利用HPLC-MS/MS技术对苹果汁培养基中P.expansum的胞外分泌蛋白进行分析鉴定,共鉴定出166个(24 h)和272个(72 h)胞外分泌蛋白,其中功能已知的分泌蛋白与RNA-Seq信号肽预测的分泌蛋白数据基本吻合。鉴定得到的胞外分泌蛋白其主要包括与碳水化合物代谢、次生代谢等相关蛋白及一部分功能未知的蛋白。3、结合RNA-Seq数据与分泌蛋白组数据选择PEX1_069590(Lipase,class 3)、PEX1_031490(Peptidase aspartic,catalytic)和PEX1_048740(Peptidase S10,serine carboxypeptidase)基因作为候选效应子进行生化和分子水平功能分析;结果显示,在三种酶特异性抑制剂存在条件下,P.expansum侵染和青霉病害的发生受到明显抑制,表明这三个基因在P.expansum侵染过程中可能发挥着关键作用。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.611.19
【部分图文】：

图 2.1 P. expansum 的生长和毒素积累Fig. 2.1 The growth and patulin accumulation of P. expansumA：菌体生长量；B：棒曲霉素含量2.4.2 样品 RNA 提取质量检测利用 Nanodrop2000 微量紫外可见分光光度计对提取的 RNA 进行浓度和质量分析（表 2.2）。检测结果显示提取的样品 RNA 浓度均>250 ng/μL，OD260/280值均在 1.8-2.2 之间，OD260/230值均≥1.0，表明提取的样品 RNA 纯度较高、能满足后续 RNA-Seq 的要求和建库标准。利用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳对样品 RNA纯度检测结果表示，RNA 条带清晰，RNA 的完整性较好（图 2.2）。表 2.2 样品 RNA 浓度检测结果Table 2.2 The concentration test of sample RNA样品名 浓度（ng/μL） OD260/OD280OD260/OD230

图 2.2 样品 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig. 2.2Agarose gel electrophoresis of sample RNA别代表苹果汁和察氏培养基，24 和 72 代表培养时间（h据统计结果eq 的各个样品的原始测序片段均大于 6.57 Gb，测差异基因表达明显而丰度不足的情况。各样品的 Q1%的比例均达到 95.4%以上，GC 含量在 54.26%至测序质量均较好，且样本基因覆盖率在 90%-100%（表 2.3，2.4）。表 2.3 RNA-Seq 数据统计结果Table 2.3 The data statistics of transcriptome sequencing序片段（G） 高质量序列 序列平均长度 Q30/%

图 2.3 差异基因表达情况统计Fig 2.3 Differential gene expression statistics基因 GO 注释分析据库对 P. expansum 孢子在苹果汁培养基培养 24 h、40 个差异基因进行 GO 注释分类分析（图 2.4）。GO biological process，BP）、细胞组分（cellular compomolecular function，MF）三大类。培养 24 h 时，注释生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（M别是 39.3%，41.2%，19.5%。培养 72 h 时，上调表达比 41.4%，40.2%，18.4%。学过程（BP）主要包含 23 个亚类，24 h、72 h 基因胞过程（cellular process）、代谢过程（metabolic pr

【参考文献】

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本文编号：2824674