MiR394在植物与灰霉菌互作中的生物学功能及调控机制研究

发布时间：2020-09-29 18:26

　　植物在生长发育过程中很容易受到周围环境的影响,由病原体灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰霉病是危害番茄生产的主要因素之一。根据课题组前期的研究结果显示,miR394响应灰霉菌的感染。本研究利用过表达miR394的转基因拟南芥和lcr突变株拟南芥,进一步明确了miR394在番茄防御灰霉病过程中的功能及其作用机制,主要研究结果如下:1、用灰霉菌处理Micro-Tom番茄,在不同时间点进行样品采集,qRT-PCR结果表明,miR394参与植物对灰霉菌的防御。2、为了进一步确定miR394的功能作用,我们将过表达miR394的转基因及其靶基因lcr的突变株拟南芥接种灰霉菌。发现与野生型相比,过表达miR394的转基因拟南芥和lcr突变株拟南芥的叶片表面均出现较大的病变面积,且综合台盼蓝染色的结果,说明拟南芥miR394通过直接作用于靶基因LCR作为拟南芥防御灰霉菌感染的负调节剂,使得植物对灰霉菌更加敏感。3、转基因株系中miR394的过表达对其它胁迫相关miRNAs产生影响。利用qPCR检测结果显示除miR159以外,miR156、miR168以及miR172的表达水平在各个株系中均上调,表明这些miRNAs与miR394存在潜在联系。4、对mi RNA合成和作用过程中的7个相关蛋白基因在转基因株系中进行表达检测,其中DDL、DRB4和AGO1共3个基因的表达上调,说明miR394的过表达对这些基因具有正反馈作用。5、植物中的两条激素调节途径:茉莉酸及水杨酸途径中的4个关键基因在过表达miR394的转基因植株和lcr突变株中被检测,高水平的miR394或低水平的LCR均导致PDF1.2(Plant Defensin1.2)和PR4(Pathogenesis-Related protein 4)表达量的增加,这可能也作为一种潜在的影响因素,使得miR394/LCR对灰霉菌感染的敏感性增强。6、已有相关报道揭示mi R394参与植物的非生物胁迫应答,我们对此进行了验证,并得到一致的结果,说明mi R394的过表达使得拟南芥耐旱而不耐盐。本研究探讨了miR394/LCR在拟南芥抵抗灰霉菌中的作用,明确了miR394/LCR在应答灰霉菌时可能协同JA/SA途径的相关基因。这些研究将为进一步明确miR394/LCR的调控机制和灰霉菌的分子防治提供技术依据。
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.412
【部分图文】：

双链体,植物,拟南芥,甲基化

碱基切割以产生pre-miRNA发夹结构，并再次剪切生成miRNA/miRNA*双链，DCL1 催化的第一次切割虽然遵循“loop-last”，但 miR319 独特且精密的“loop-first”加工模式存在于天然的小立碗藓，水稻和拟南芥，甚至基于拟南芥 miR319的骨架来构建人工 miRNA（artificial MIRNA， aMIRNA）[18, 21, 41-43]。大多数植物 pri-miRNA 发夹产生单个 miRNA / miRNA*双链体，但是一些基因座（包括MIR159 和 MIR319）始终产生多个双链体[21,41,42,44]。植物 miRNA 的生物合成在细胞核内完成，在特定的亚核区域被称为 D-body[45-47]。最初的 miRNA / miRNA*双链体的 3' 核苷酸需要被核 HEN1 蛋白质 2' -O-甲基化[48-50]。2'-O-甲基化标记可以防止 miRNA 免受 3' 末端尿苷化和 3'→5' 外切核酸降解[49, 51]。在植物中，HASTY作为一种动物Exportin-5转运蛋白的同系物，被认为是将miRNA/miRNA*双链体运输到细胞质 AGO 蛋白中，其中 AGO1 是植物 miRNA 的主要载体[52,53]。在拟南芥中 AGO1 蛋白可使用固有的 RNaseH-like 活性来切割（“slicer”）靶标 mRNA，其它大多数植物 AGOs 也可能拥有切片功能[21, 54, 55]。

转录本,番茄,组织表达,特异性

第三章实验结果1. MiR394 在番茄和拟南芥中的组织特异性表达1.1 MiR394 及其初级转录本在番茄不同组织中的表达我们希望对 miR394 的功能进行更深层次的分析，但是发现 miR394 在番中有两种存在形式 miR394-5p 和 miR394-3p（miR394*），因此我们对 miR394 组织表达特异性进行了研究。使用 qPCR 在以下四种番茄组织：茎、叶、花和实中检测了两种成熟 miRNAs 及其初级转录本的表达水平。结果显示两miR394 及 pri-miR394 均存在于以上四种组织中，但在各个组织中表达水平有不同。Pri-miR394 的水平在果实中最低，茎中最高，叶和花中的表达水平居中（2A）。MiR394-5p 在花中最低，茎中最高，叶和果实居中（图 2B）。而 miR393p 的水平在茎中最低，花中最高，在叶和果实居中（图 2B）。与 miR394-5p 比，除了花以外，在番茄另外三个组织中 miR394-3p 的表达水平显著降低（2B）。因此，综合以上结果我们选择了 miR394-5p 用于后续的实验研究中。

拟南芥,表达水平,灰霉菌,番茄品种

4-5p 和 miR394-3p 在 4 个拟南芥组织中ion levels in 4 Arabidopsis tissues betwe3p的侵染录本在接种灰霉菌的番茄叶片中在接种了灰霉菌的番茄叶片中的应 miR394 及其初级转录本 pri-miR的番茄中，miR394 的表达没有显番茄品种 Micro-Tom 叶片中，不同之前在接种灰霉菌的番茄品种金棚结果[94]。其中 pri-miR394 除在接其它时间点都有所下降（图 3C）。达量确实有所变化，说明 miR394

【参考文献】