多花黄精叶枯病病原菌鉴定及贝莱斯芽胞杆菌防病促生效果研究

发布时间：2020-10-10 03:21

　　多花黄精为百合科黄精属植物,被《中国药典》(2015年版)收录,是一味药食同源的中药材。截至2018年,人工栽培已成为黄精主要生产模式,为此栽培过程中常受到多种病原菌侵害,如叶斑病、炭疽病等。在浙江省黄精种植基地中,发现一种发病比较严重的病害,该病的发病症状为在叶片顶端先形成病斑,后不断扩大,最终整个植株叶片枯死,为区分此种症状,起名为多花黄精叶枯病,该病害严重影响多花黄精根茎的生长和产量。为此,本文对多花黄精叶枯病的病原、多花黄精的内生菌、生防菌的防病效果及其拮抗机制和促生机理进行了研究,具体结果如下:1、对多花黄精的感病植株进行病原菌的分离、鉴定,分离得到5株真菌,对其进行致病性测定,发现只有菌株PC-4具有致病性。根据形态学、rDNA-ITS和TEF-1α序列同源性分析,对该病害的致病菌种进行鉴定,最终确定导致多花黄精叶枯病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。2、从多花黄精根茎中分离获得11株内生细菌,经鉴定分别属于3个属,其中芽胞杆菌属为多花黄精内生细菌的优势菌属,采用平板对峙法筛选出一株对尖孢镰刀菌F.oxysporumPC-4具有抗菌效果的内生拮抗菌ZJU-3,通过形态学观察、生理生化测定、16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析,最终鉴定菌株ZJU-3鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis。3、盆栽实验测定B.velezensisZJU-3的生防效果,发现OD600=0.5生防菌液的病情指数为39.5%,而只接种病原菌的对照组的病情指数为70.8%,防病效果为44.2%,可见B.velezensisZJU-3可有效降低发病率。4、多花黄精和滇黄精组培试验中,发现B.velezensB.ZJU-3发酵液均可以对株高、鲜重有促生作用,对叶片中叶绿素含量无影响。温室栽培试验结果发现该菌株对多花黄精具有显著的促生效果,根长和单株根数明显高于对照组。对发酵液中激素种类进行利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行分析,发现B.velezensis ZJU-3产生多种植物内源激素如IAA、kinetin、zeatin、GA3,其浓度依次为8.29 ng/mL、21.34 ng/mL、0.02 ng/mL、0.07 ng/mL。5、利用浓度梯度法对菌株进行利福平的抗性诱导,筛选出保持抗菌活性的抗利福平的突变体Rif-B.velezensis ZJU-3,其对利福平的抗性达到150 μg/mL。通过叶片接种、组织分离,发现叶片内Rif-B.velezensis ZJU-3菌株数量为2×105个/g。6、菌丝生长速率测定结果显示,拮抗菌ZJU-3无菌发酵液对F.oxysporum PC-4菌丝生长均有抑制作用,随着培养基中发酵液添加比例的增加,抑菌效果增强,当加入5%发酵滤液时,菌落直径为3.78cm,对照为4.87cm,抑制率为22.3%。对B.velezensisZJU-3发酵液抗菌活性稳定性分析,发现贝莱斯芽胞杆菌B.velezensisZJU-3发酵液抗菌活性不受温度、pH、蛋白酶K和金属盐离子影响。7、抑菌谱测定试验发现拮抗菌ZJU-3对铁皮石斛炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、大豆炭疽病(C.truncatum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、西红花茄病镰刀菌(F.solani)、棉花立枯丝核病菌(Rhizoctoniasolani)、西瓜枯萎病菌(F.oxyporum f.sp.niveum)的菌丝都有较强的抑制作用,抑菌效果分别为71.8%、79%、55%、58.4%、75.1%和66.4%,且部分病菌菌丝缩短变粗、扭曲、变黑、表面出现褶皱,产孢量明显减少,可说明该菌株具有一定的广谱抗性。8、抑菌物质检测发现,B.velezensis ZJU-3能够产生嗜铁素、蛋白酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶,不分泌几丁质酶。根据脂肽类抗生素合成相关基因序列(fenA、sfp、ituA)对目标菌株进行PCR扩增,发现贝莱斯芽胞杆菌B.velezensB.ZJU-3的基因组中可能存在泛革素、伊枯草菌素和表面活性素的代谢合成操纵子序列。MALDI-TOF-MS检测结果表明生防菌B.velezensis能够产生丰富的脂肽类抗生素,包括泛革素、表面活性素和伊枯草菌素三个家族。利用盐酸沉淀和甲醇抽提法获得了菌株ZJU-3发酵液中脂肽粗提物,确定该脂肽粗提物具有明显抑制尖孢镰刀菌菌丝生长的能力,抑制率达到51.6%。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.672
【部分图文】：

感病,症状,植株,病斑

在叶片顶端先形成病斑，后不断扩大，在叶部形成椭圆形或不规则的水浸逡逑状病斑，叶片边缘变黄褐色，最终整个叶片枯死，病叶枯死后，不脱落，悬挂于茎秆。逡逑如图２．１所示。与周先治（２０１７）报道的黄精枯萎病症状相似，但是其报道中病原菌逡逑只鉴定到镰刀菌属，尚未进一步鉴定到种。逡逑遇邋１９＾１逡逑图２．１多花黄精感病植株症状逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｎａｔｕｒａｌｌｙ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｃｙｒｔｏｎｅｍａ邋Ｈｕａ逡逑２．３．２病原菌分离逡逑以感病的多花黄精叶片作为材料，根据菌落外观形态、颜色，去除表观上相同的逡逑菌株（见图２．２），得到５株真菌（ＰＣ－丨？ＰＣ－５）。逡逑Wｎｎｍ逡逑图２．２分离得到的不同菌株的形态逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｏｆ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｃｙｒｔｏｎｅｍａ邋ｌｌｕａ逡逑１４逡逑

致病性,菌落,白色,灰白色

菌株编号逦菌落特征逡逑Ｓｔｒａｉｎ邋ｎｕｍｂｅｒ逦Ｃｏｌｏｎｙ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ逡逑ｐｃ＾ｉ逦菌落初白色，后为灰白色，有黑色颗粒逡逑ＰＣ－２逦菌落灰黑色，表面形成黑色球形粒点逡逑ＰＣ－３逦菌落初白色，后为灰白色，表面干燥，菌落不ＰＣ－４逦菌落初期呈淡红色或白色，后期出现淡紫色色ＰＣ－５逦菌落呈白色绒毛状，干燥，不透明逡逑的致病性测定逡逑离物接种５盆长势一致的多黄黄精盆栽苗，每个处理接现ＰＣ－４致病（见图２．３），接种１０ｄ后，叶片接种位置向叶片边缘扩散，培养３周后，接种ＰＣ－４的植株叶片干

菌落形态,菌落形态,菌株

得序列在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ比对，确定该分离菌株为接种菌株，完成柯赫氏法逡逑则，可以认定ＰＣ－４为多花黄精叶枯病的致病菌。逡逑图２．４邋ＰＣ－４菌株的初次分离菌落形态与接种后发病叶片再次分离菌株形态对比逡逑Ｆｉｇ邋．２．４．邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｐ（邋－４邋ｕｎｃｉ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌａｓｔ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．逡逑２．３．４菌株ＰＣ－４的形态特征逡逑２．３．４．１菌落特征逡逑菌落初期呈淡红色或白色，后期颜色加深，出现淡紫色或深紫色色素。气生菌丝逡逑丰富且呈绒毛状。培养皿背面观察，菌落初期呈白色且色泽均匀，后期呈淡红色至紫逡逑色。多次纯化后，部分纯化菌落会出现颜色变化的情况。逡逑３ｄ逦６ｄ逦９ｄ逦ｌｉｄ逡逑ｏｎｎｎ逡逑ｈ邋□□□□逡逑图２．５不同培养时间的菌株ＰＣ－４的菌落形态逡逑Ｆｉｇ．２．５邋Ｃｏｌｏｎｉｅｓ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋ＰＣ－４邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．４．２光学及扫描显微镜观察结果逡逑通过光学显微镜和扫描电镜观察，菌丝为有隔菌丝，该菌株的分生孢子有两种类逡逑型：一种比较大，孢子呈纺锤形或镰刀形，大小为（１５￣２５）邋｜Ｌｉｍ邋ｘ邋（３￣５）邋（ｉｍ，有逡逑１６逡逑

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