松墨天牛嗅觉受体orco基因挖掘及其功能验证

发布时间：2020-10-13 12:11

　　 松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)是松树的毁灭性病害松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的主要媒介昆虫,防控松墨天牛可以有效控制松材线虫病的传播。昆虫嗅觉是昆虫多项生理行为的基础,但目前对松墨天牛的嗅觉识别机制还尚未明确,而嗅觉共受体(odorant receptor coreceptor,Orco)在昆虫嗅觉系统中发挥作用,且其在不同昆虫体内高度保守而具有一定的研究前景。对昆虫嗅觉深入研究,广泛应用于害虫管理,是害虫防治的新手段。为了开发更高效的调控技术和设计出特定嗅觉蛋白,在对松墨天牛嗅觉识别机制研究的基础上还要探究其各嗅觉受体相关蛋白和功能。本研究基于嗅觉受体的研究进展,对松墨天牛orco基因组结构展开分析,深入探究其表达特征,并对受体基因orco进行RNA干扰实验,主要结论如下:为系统的分析松墨天牛嗅觉识别过程中相关的嗅觉受体,本研究利用转录组测序技术对松墨天牛成虫触角构建转录组本,转录组测序共得到53,015个Unigenes,平均长度745 bp,属于正常范围。在松墨天牛成虫触角转录本中挖掘得到8个CSPs,53个IRs,12个OBPs,37个ORs,1个orco,将挖掘到的orco与其他昆虫的orco进行进化树构建,发现其与鞘翅目同属昆虫光肩星天牛亲缘关系最为接近,与其他昆虫则较远,这与生物学进化地位相对一致,说明orco在进化过程中相对保守又有一定的变异,而松墨天牛orco全长序列的鉴定为进一步探索嗅觉受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供前期基础。通过PCR扩增技术成功克隆得到松墨天牛orco气味受体基因,orco基因全长1,434 bp,共编码477个氨基酸。通过对松墨天牛嗅觉受体orco基因进行克隆、鉴定和生物信息学分析,松墨天牛Orco受体蛋白是一个具有七个跨膜结构的疏水性蛋白,未预测到具有信号肽位点,同时Orco氨基酸序列中共存在21个N-糖基化修饰位点,47个磷酸化位点,说明了松墨天牛Orco可能具有的生物学功能。运用RT-qPCR技术对松墨天牛成虫不同组织与不同发育时期进行表达差异分析,松墨天牛Orco在成虫触角中高表达,在其他部位如头、胸、腹、足、翅膀等也有检测到,且表达量表现为头腹翅膀足胸。在松墨天牛成虫不同发育时期中,Orco在成虫末期中表达量显著高于其他发育时期,而且雌虫触角表达量明显高于雄虫。对松墨天牛表达模式的研究可为下一步鉴定其功能提供理论依据。利用RNAi技术沉默松墨天牛orco基因,通过RT-qPCR证明RNAi技术在鞘翅目昆虫松墨天牛中的成功应用,通过注射dsRNA,Orco表达量显著降低。EAG及行为学测定结果显示,松墨天牛orco基因的沉默会降低引诱剂、松节油及性信息素引起的电位变化,也会使其对气味分子的行为趋向表现为随机性,即orco基因的沉默可能会对松墨天牛的正常的嗅觉识别过程造成影响。对orco在松墨天牛嗅觉识别过程中所发挥的生物学功能以及利用该基因揭秘松墨天牛嗅觉传导机制奠定基础,为松墨天牛靶标防治提供了潜在的可能,有助于研发防控害虫的新技术。研究发现其在不同昆虫体内的高度保守性以及在嗅觉识别机制中的独特地位,预示其可能是破坏昆虫嗅觉信号的一个潜在靶标,从而通过嗅觉干扰防控松墨天牛数量限制松材线虫病的传播。这将为松材线虫病的综合防治提供新方向。预期结果不仅为以松墨天牛Orco作为潜在的分子靶标开发和利用新型高效的杀虫剂、引诱剂和驱避剂打下坚实的基础,而且对研究松墨天牛寄主选择行为机制提供科学依据,同时为探究松墨天牛行为调控和控制松材线虫病传播发挥着重要作用。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S763.38
【部分图文】：

弃废液；的 2mL 收集管，加入 400μLRNs，弃废液；L 收集管，加入 500 μL RNAWa废液； 2 mL 收集管，加入 500 μL RNAs，弃废液；附柱移至新的 1.5 mL 离心管中，r（70℃预热）加入吸附柱，室温。定 RNA 样品的浓度，Qubit 2.0 测性，是为了确保样品可以到达转 Illumina 测序程见图 2-1：

图 2-2 松 牛 Unigene 长度分布图Fig. 2-2 Length distribution of Unigenes in M. alternatus Hope.3 预测蛋白质的注释所有组装的 Unigenes 用作 NR，Swiss-Prot，GeneOontology（GO），直群集（COG），KOG 和 KEGG 数据库的输入 BLAST 和 HMMER 参数 E 设置为 10-5 和 10-10，我们是能够获得 23,748 个 Unigenes 的注释信息，区的 44.79％，其余的单基因序列（55.21％）在现有数据库中具有无显着配，这说明其中可能含有新的序列信息，或者含有大量鞘翅目特异性昆虫转录本。有 12,651 个 Unigenes 在 NR 数据库中被注释，参考标准选取 E 结果，松墨天牛有 34.28%的序列与同属鞘翅目的赤拟谷盗（Tribostaneum）具有同源性。有 10.89%的序列与同属鞘翅目的中欧山松大Dendroctonus ponderosae）具有同源性，而比对到其他昆虫的序列所占比.14%（图 2-3）。

图 2-2 松 牛 Unigene 长度分布图Fig. 2-2 Length distribution of Unigenes in M. alternatus Hope测蛋白质的注释有组装的 Unigenes 用作 NR，Swiss-Prot，GeneOontology（GO）（COG），KOG 和 KEGG 数据库的输入 BLAST 和 HMMER 参数为 10-5 和 10-10，我们是能够获得 23,748 个 Unigenes 的注释信息 44.79％，其余的单基因序列（55.21％）在现有数据库中具有无说明其中可能含有新的序列信息，或者含有大量鞘翅目特异性昆本。有 12,651 个 Unigenes 在 NR 数据库中被注释，参考标准选取，松墨天牛有 34.28%的序列与同属鞘翅目的赤拟谷盗（um）具有同源性。有 10.89%的序列与同属鞘翅目的中欧山松roctonus ponderosae）具有同源性，而比对到其他昆虫的序列所占（图 2-3）。
【参考文献】

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本文编号：2839152