柑橘黄化脉明病毒和柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆构建

发布时间：2020-10-15 12:08

　　 柑橘病毒病害每年都会对世界柑橘产业造成严重的经济损失。柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow clearing vein virus,CYVCV)作为2009年我国发现侵染柑橘的一种新病毒,会引起柠檬和酸橙嫩叶脉明、黄化、叶片反卷和皱缩等症状,严重时可导致嫩叶脱落、叶脉坏死,造成树势衰弱、果实产量下降,有时甚至绝收;近几年,该病毒在我国柑橘产区的发生呈现逐年上升趋势,已经成为影响我国柑橘产业尤其是柠檬产业的一个重要问题。柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)是乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)柑橘病毒属(Citrivirus)的代表成员,可侵染大多数的柑橘品种,中国于2016年在甜樱桃和猕猴桃上首次发现,后续在柠檬上也有报道。目前对CYVCV和CLBV的分子特性和生物学特性研究较少,而植物病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能的重要工具。然而利用大肠杆菌构建基因组较大的病毒全长侵染性克隆时,会出现基因组结构(突变及缺失)不稳定的现象。因此本研究首先分别对CYVCV和CLBV分离物进行了全长cDNA的扩增,然后通过基于酵母转化的同源重组(transformation-associated recombination,TAR)技术分别成功构建了CYVCV和CLBV的基因组全长侵染性克隆,为进一步研究两种病毒的分子生物学特性、致病机理及其载体化应用奠定了基础。所取得的主要研究结果如下:1、病毒侵染性克隆的快速构建体系本研究利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制和表达的三元穿梭载体pCY(Genbank登录号:MG637043);进而建立了基于pCY及TAR技术的快速克隆体系,然后利用Potato Virus X(PVX)对该体系进行验证,在2周内获得了PVX侵染性克隆。2、CYVCV侵染性克隆构建本研究建立了CYVCV基因组的一步法RT-PCR扩增体系;通过TAR技术克隆至三元载体pCY,成功获得柑橘黄化脉明病毒四川安岳分离物基因组全长cDNA克隆,测序结果表明CYVCV-AY基因组为7529 bp,包含6个开放阅读框,与目前已报道的CYVCV分离株一致。选取一致序列进行提交并命名为:CYVCV-AY(Genbank登录号:MG878869);序列比对结果显示,随机选取的4个CYVCV-AY基因组全长cDNA克隆的核苷酸序列相似性均在99%以上;在系统进化树上,CYVCV-AY的4个克隆均与柑橘来源的CYVCV分离株聚为一簇。通过TAR克隆在国内外首次获得了CYVCV的侵染性cDNA克隆,症状观察及RT-PCR检测结果表明,所获得的pCY-CYVCV具有侵染性。农杆菌介导接种试验表明,接种方式和所选取的寄主对侵染效率有较大影响;所获得的pCY-CYVCV全长cDNA采用农杆菌介导的真空浸润柑橘,其侵染效率比较高。3、CLBV侵染性克隆构建利用所建立的柑橘病毒侵染性克隆的快速构建体系,首次获得了CLBV中国分离株的侵染性克隆HBYD(Genbank登录号:MG572236)。序列测定显示,CLBV-HBYD基因组长度及结构与目前已报道的来自柑橘的CLBV分离株一致,为8747 bp,包含3个开放阅读框,ORF1为5889 nt、ORF2为1089 nt、ORF3为1092 nt,5′端有甲基化帽子结构,3′末端具有poly(A)。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性在79%~98%,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在系统进化树上,MG572236与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇。在侵染性克隆的基础上,构建了插入亚基因组启动子及GFP基因开放读码框的pCLBV表达载体。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.66
【部分图文】：

第一章 文献综述第一章 文献综述 柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）研展1 发生与分布由柑橘黄化脉明病毒（CYVCV）引起的柑橘黄化脉明病，是一种新发现的柑橘病毒病害。最早是 1988 年在巴基斯坦的柠檬和酸橙上发现[1, 2]，其病毒会引起柠檬和酸橙出现嫩叶、黄化、叶片反卷和皱缩等症状（图 1），严重时可导致嫩叶脱落、叶脉坏死，造成树势、果实产量下降、有时甚至绝收。1996 年 Grimaldi 和 Catara 在出现黄化脉明症状的柠片上观察到一种纤维状病毒粒体，随后在印度的香橼、酸橙和柠檬等不同品种上也被观[3]，并在巴基斯坦[4]、土耳其[5]迅速蔓延。中国于 2009 年在云南瑞丽柠檬上首次发现[6, 7]，在重庆、四川、江西等地也相继发现该病[8-10]。

图 1.2 CYVCV-Y1 的病毒粒子结构图tained particles of citrus yellow vein clearing virus (CYVCV单链 RNA 病毒，CYVCV 的基因结构具有一定的稳定性产生较大变异[12]，现发现的基因组有两种类型，一种为酸，包含 5′和 3′端非编码区（UTR）、6 个开放阅读框（Op）尾巴(图 3)。CYVCV 的 6 个开放阅读框都起始于 A TGA（ORF2、3、6）。其中，RNA 依赖的 RNA 聚合的保守结构域由 ORF1 编码；ORF2、ORF3 和 ORF4 组locks, TGB)，分别编码病毒在植物中的运动相关蛋白 TGa 的蛋白，其中包含一个大的病毒解旋酶结构域、一个 化基团；TGB2 是一个 12k Da 的蛋白，包含一段植物病r family）的保守结构域，TGB3 是一个 6.4 k Da 的蛋白，铃薯 X 病毒属“7kDa 的病毒外壳蛋白”保守结构域的Coat protein, CP），包含一个柑橘病毒属的保守结构域；

图 1.3 CYVCV 的 RNA 基因组结构图REP：复制相关蛋白；M：病毒甲基转移酶；A：AlkB 蛋白区域；H：病毒解旋酶；R：依赖 RNA 的 RNA聚合酶；TGB：三基因盒；CP：外壳蛋白；23K：23kDa 蛋白Fig. 1.3 Schematic representation of the RNA genome of Citrus yellow vein clearing virusCYVCVREP: Replication-associated polyproteins; M: Viral methyltransferase domain; A: AlkB-like domain; H: Viralhelicase domain; R: RNA-dependent RNA polymerase 2 domain; TGB: Triple gene block; CP: Coat protein; 23K:Encoded putative protein of 23 kDa寄主范围及传播途径CYVCV 寄主比较广泛，可通过嫁接在大多数柑橘品种间传播，但仅在柠檬、酸橙、香橼等柑橘品种上表现典型的黄化脉明症状[13]。CYVCV 侵染林娜脐橙（C .sinensis）及其他少数品种柑橘后，会导致叶片上轻微的斑点和类似环斑等症状[2]。但是，CYVCV 侵染墨西哥莱檬（C. aurantifolia）、葡萄柚（C. paradis）及少量宽皮柑橘（C.reticulata）等品种柑橘上并不表现症状[11]。CYVCV 还能通过摩擦接种的方式感染菜豆（P. vulgaris）、豇豆（V. unguiculata）、1.1.3
【参考文献】

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本文编号：2842152