Serpin2和βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能研究

发布时间：2020-10-16 21:30

　　 昆虫的天然免疫分为细胞免疫(cellularimmunity)和体液免疫(humoral immunity)。昆虫的细胞免疫是指多种血细胞参与的防卫反应,包括吞噬作用(cytophagy)、结节形成(nodulation)和细胞包囊(encapsulation);体液免疫涉及抗菌肽的诱导、酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)激活导致的黑化反应(melanization)。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor,Serpin),是血淋巴中对丝氨酸蛋白酶有抑制作用的一类蛋白质,用来调节昆虫内环境的平衡。β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucanrecognitionprotein,βGRP)作为一种模式识别蛋白,能够识别真菌的细胞壁成分,在昆虫的免疫系统中占有重要地位。本文利用RT-PCR和RACE扩增技术,克隆了亚洲玉米螟幼虫Serpin2基因的全长cDNA序列。该基因全长1447bp核苷酸,其中包含一个1137bp的开放阅读框(ORF),一个163 bp的5'非编码区(5'UTR)和一个147bp的带有加尾信号的3'非编码区(3'UTR)。开放阅读框从第164个核苷酸开始,终止于第1300个核苷酸,共编码378个氨基酸。Of-Serpin2的计算分子量约为41.71kDa,估测等电点pI为5.29。生物信息学分析表明:Of-Serpin2无跨膜结构域,N端无信号肽,不存在糖基化位点,含有39个磷酸化位点,均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明:Of-Serpin2的氨基酸序列与尺蠖Lonomia obliqua Serpin2、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua Serpin2、野桑蚕 Bombyx mandarina Serpin2、家蚕 Bombyx mori Serpin2、大斑蝶Daanaus plexippus Serpin2高度同源。三维结果显示,Of-Serpin2有8个α螺旋,3个β折叠。利用RNA干扰技术,研究干扰βGRP3基因后亚洲玉米螟幼虫体内与体液免疫相关基因Serpin1、PAP、PPO等的表达情况,以及对细胞免疫能力的初步影响。以DEPC水处理组和绿色荧光报告蛋白(GFP)处理组为阴性对照,制备了βGRP3和GFP的dsRNA,采用注射方法,分别将βGRP3和阴性对照GFP的dsRNA导入4龄初亚洲玉米螟幼虫体内,采用实时荧光定量PCR检测RNAi后幼虫体内Serpin1、PPO、PAP等免疫相关基因在转录水平的变化,进一步分析RNAi对血淋巴中PO活性的影响,探索βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能。结果表明:将βGRP3基因干扰后72h,亚洲玉米螟幼虫体内该基因的表达量开始明显降低(P0.05),表明注射βGRP3dsRNA可以有效下调βGRP3基因的转录水平。与此同时,其免疫相关基因PAP(酚氧化酶原激活蛋白酶)、PPO(酚氧化酶原)的表达量也显著低于对照;干扰后幼虫体内PO酶活性在72 h开始呈现显著下调,这表明Of-βGRP3正调控PO活性,即在PPO级联调控中起重要作用。对干扰后亚洲玉米螟幼虫血细胞观察发现,72h开始,类绛色细胞、浆血细胞和原血细胞的数量开始下降(P0.05),而粒血细胞数量增加,且浆血细胞在96 h后的数量开始回升,同时与对照组相比,处理组的总细胞数并没有发生明显变化(P0.05),说明宿主昆虫在受到外来入侵物影响时,其血细胞会自行进行免疫调节,以维持宿主昆虫体内的正常生理活动。RNAi后再次注射细菌,发现只注射大肠杆菌处理组的致死中时间(3d)显著大于RNAi处理后二次注菌处理组(1 d),结果表明:βGRP3在昆虫抵抗病原菌侵染中起重要作用。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.132
【部分图文】：

３．１．１?（９／－—／？２?基因全长?ｃＤＮＡ?序列的?３ｒ－ＲＡＣＥ?和?５ＬＲＡＣＥ??在己知的中间片段基因序列基础上设计特异性的引物，利用３＇－ＲＡＣＥ进彳丁?ｃＤＮＡ末端??快速扩增，３ＬＲＡＣＥ通过两对不同引物扩增得到的产物长度均为６００?ｂｐ?（图１．３、图１．５）。??将目标条带割胶回收，连接ＰＭＤ－１８Ｔ载体，转化进ＴｏｐｌＯ感受态细胞，筛选阳性克隆，单??克隆挑斑鉴定结果如下图（图１．４、图１．６）。５＇－ＲＡＣＥ通过引物扩增得到的长度约为１２００?ｂｐ??（图１．７），单克隆挑斑鉴定如下图（图１．８）。??ｂｐ?１?２?３??＿纖＿議＿議＿＿＿＿＿議＿＿＿＾??２?鋪（Ｉ?—??４鄕?Ｊ?：?ｂ—＾＾ｎｌ??扉??图１．３亚洲玉米螟幼虫＆７７如２基因的第一次３＇－ＲＡＣＥ扩增产物??注：Ｍ，标准分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－３，３＇－ＲＡＣＥＰＣＲ扩增产物的电泳结果??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?．一一＿馨、暴豪：端＇瀘??１０００?＂?；?％§ｆ?＾?ｌｌ???＿＿?ＯｆＳｅｒｐｉＢｌ??５００?變靡？蕾心實??２５０??售??１００?■?Ｅ，?＇赢爲＿蠢ｆ厂甚??图１．４亚洲玉米螟幼虫＆ｒ；？／？２基因的Ｔ－ＲＡＣＥ扩增产物菌落ＰＣＲ鉴定??注：Ｍ，标准分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－５，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ扩增产物的电泳结果??

３．１．１?（９／－—／？２?基因全长?ｃＤＮＡ?序列的?３ｒ－ＲＡＣＥ?和?５ＬＲＡＣＥ??在己知的中间片段基因序列基础上设计特异性的引物，利用３＇－ＲＡＣＥ进彳丁?ｃＤＮＡ末端??快速扩增，３ＬＲＡＣＥ通过两对不同引物扩增得到的产物长度均为６００?ｂｐ?（图１．３、图１．５）。??将目标条带割胶回收，连接ＰＭＤ－１８Ｔ载体，转化进ＴｏｐｌＯ感受态细胞，筛选阳性克隆，单??克隆挑斑鉴定结果如下图（图１．４、图１．６）。５＇－ＲＡＣＥ通过引物扩增得到的长度约为１２００?ｂｐ??（图１．７），单克隆挑斑鉴定如下图（图１．８）。??ｂｐ?１?２?３??＿纖＿議＿議＿＿＿＿＿議＿＿＿＾??２?鋪（Ｉ?—??４鄕?Ｊ?：?ｂ—＾＾ｎｌ??扉??图１．３亚洲玉米螟幼虫＆７７如２基因的第一次３＇－ＲＡＣＥ扩增产物??注：Ｍ，标准分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－３，３＇－ＲＡＣＥＰＣＲ扩增产物的电泳结果??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?．一一＿馨、暴豪：端＇瀘??１０００?＂?；?％§ｆ?＾?ｌｌ???＿＿?ＯｆＳｅｒｐｉＢｌ??５００?變靡？蕾心實??２５０??售??１００?■?Ｅ，?＇赢爲＿蠢ｆ厂甚??图１．４亚洲玉米螟幼虫＆ｒ；？／？２基因的Ｔ－ＲＡＣＥ扩增产物菌落ＰＣＲ鉴定??注：Ｍ，标准分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－５，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ扩增产物的电泳结果??

１識三，：：心．「一??图１．６亚洲玉米螟幼虫＆ｒ／？＞７２基因的３＇－ＲＡＣＥ扩增产物菌落ＰＣＲ鉴定??注：Ｍ，标准分子量ＤＭＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－８，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ产物的电泳结果??Ｉ?—??图１．７亚洲玉米螟幼虫基因的第一次ｙ－ＲＡＣＥ扩增产物??注：Ｍ，标准分子量ＤＮＡ?（ＤＬ５０００）?；?１－５，５１ＡＣＥＰＣＲ扩增产物的电泳结果??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 周淑香;鲁新;李丽娟;张国红;丁岩;刘宏伟;;不同化性亚洲玉米螟单倍型分析[J];植物保护学报;2012年04期

2 张玉江,丁永楼;亚洲玉米螟为害水稻初步观察[J];中国稻米;1995年03期

3 慕立义;王开运;;亚洲玉米螟对六六六抗药性及取代药剂的研究[J];植物保护学报;1987年03期

4 卿九龄,陈昌兰,王克钰,黄仁军;万县地区亚洲玉米螟的鉴定[J];四川农业学报;1988年02期

5 汪羞德;;亚洲玉米螟对甜玉米产量损失的影响[J];上海农业科技;1988年03期

6 慕立义;王开运;;杀虫剂室内选育亚洲玉米螟抗药性及交互抗性的研究[J];植物保护学报;1988年03期

7 忻亦芬;刘志娴;马绍元;徐文贵;;飞机喷洒Bt及Bt混剂防治亚洲玉米螟试验[J];沈阳农业大学学报;1989年01期

8 翟保平;陈瑞鹿;;亚洲玉米螟飞翔能力的初步研究[J];吉林农业科学;1989年01期

9 孟昭金;高静;陈平;王庆军;高姝;;亚洲玉米螟预测预报方法及综合防治[J];河北农业科学;2008年05期

10 杨益众，戴志一，黄东林，王春安，高泰东，王生元，张银贵，高联义;棉田亚洲玉米螟生物学的研究[J];华东昆虫学报;1996年02期

相关博士学位论文 前8条

1 涂小云;亚洲玉米螟滞育和生物学特性地理变异的研究[D];江西农业大学;2011年

2 张柱亭;亚洲玉米螟对气候变暖的响应及其对温度胁迫的适应机制研究[D];沈阳农业大学;2013年

3 白树雄;转基因抗虫玉米次生代谢物质的变化及对亚洲玉米螟寄生性天敌腰带长体茧蜂的影响[D];中国农业科学院;2011年

4 胡建;腰带长体茧蜂抵御其寄主亚洲玉米螟细胞免疫反应的机理研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2003年

5 屈明博;亚洲玉米螟几丁质合酶基因表达与生理功能研究[D];大连理工大学;2012年

6 郭井菲;亚洲玉米螟取食玉米产生的诱导抗性机制研究[D];中国农业科学院;2017年

7 黄丽莉;亚洲玉米螟不同地理种群杂交后代滞育特性与mtDNACOⅠ序列特性的研究[D];江西农业大学;2013年

8 王增霞;Cry1Ac蛋白对腰带长体茧蜂的安全性评价及两者对亚洲玉米螟生理机制的研究[D];中国农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 赵雅;Serpin2和βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能研究[D];扬州大学;2018年

2 刘雪微;亚洲玉米螟Bt抗性种群的遗传多样性研究[D];中国农业科学院;2018年

3 阿依克孜;新疆荒漠绿洲生态区亚洲玉米螟主要生物学特性及发生世代验证[D];塔里木大学;2018年

4 付军;球孢白僵菌（Beauveria bassiana）对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）产卵选择行为的调控机制[D];东北师范大学;2018年

5 张文璐;基于碳稳定同位素技术的亚洲玉米螟寄主来源研究[D];中国农业科学院;2018年

6 韩永旭;高温对亚洲玉米螟生长发育和繁殖的影响[D];沈阳农业大学;2017年

7 徐秋雯;亚致死浓度虫酰肼及Methoprene对亚洲玉米螟幼虫多巴脱羧酶基因表达的影响[D];扬州大学;2017年

8 李忠;亚洲玉米螟丝素轻链基因的克隆、表达分析及RNAi[D];扬州大学;2015年

9 吴桃燕;亚洲玉米螟免疫相关模式识别受体基因β-1,3-GRP的cDNA克隆及表达分析[D];扬州大学;2015年

10 孙光芝;第二代赤眼蜂—载菌蜂的研制及其防治玉米螟效果评价[D];吉林农业大学;2002年

本文编号：2843801