细胞壁降解酶和毒素在链格孢菌侵染枣果过程中的作用机制研究

发布时间：2020-10-17 12:39

　　 链格孢菌在侵染枣果后会引起枣黑斑病,迫使枣果在生理、组织、形态上发生一系列变化,进而导致产量和质量大幅度下降,它不仅会造成产中损失,还会对产后造成损失,这给枣产业的生产和贮藏造成了巨大的经济损失。本文以引起枣黑斑病的链格孢菌为研究对象,解析链格孢菌细胞壁降解酶和毒素在侵染枣果发病过程中的作用,阐明了链格孢菌侵染枣果的生化机制以及侵染过程中形态结构变化,为链格孢菌侵染枣果后引起的枣黑斑病防治提供理论依据。主要研究结果如下:1.枣果黑斑病菌的分离及形态学鉴定采用组织分离法对病样进行分离,共获50株微生物,其中,链格孢菌占78%,青霉菌占8%,镰刀菌占4%,黑曲霉菌占10%。将分离得到的菌株回接于健康骏枣,对其进行致病性测定,仅链格孢菌可致使枣果发病,发病率为54%。再次分离接种后发现致病链格孢菌与第一次分离得到的链格孢菌一致,确定分离得到的链格孢菌为枣黑斑病主要致病菌,并根据菌株的形态特征初步鉴定为链格孢属链格孢菌Alternaria alternata。分离出的A3组单孢菌株经验证具有较强的致病性,可用于后续链格孢菌侵染的研究。2.链格孢菌侵染枣果过程中细胞壁降解酶活性分析采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法和考马斯亮蓝(Bradford)法对链格孢菌细胞壁降解酶的活性进行分析,测定酶反应所释放的还原糖并计算细胞壁降解酶的活性。链格孢菌在寄主体外不同碳源诱导下均能产生多聚半乳糖醛酸酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶和果胶甲基反式消除酶等6种细胞壁降解酶,但不同细胞壁降解酶的活性存在一定差异,以骏枣果肉为外源诱导物,链格孢菌产生β-葡萄糖苷酶活性明显高于其它5种酶,说明β-葡萄糖苷酶在链格孢菌致病过程中有着重要的作用。以滤纸为诱导物产生的β-葡萄糖苷酶活性高于其他诱导物,其活性高达10.104 U/mg。链格孢菌侵染枣果后产生的细胞壁降解酶种类及活性与体外不同碳源诱导的结果一致,可产生6种细胞壁降解酶。其中β-葡萄糖苷酶活性高于其他5种酶,且病健交界处β-葡萄糖苷酶的活性明显高于受侵染后的发病部位和未被侵染的部位。该测定结果表明链格孢菌在致病过程中起关键作用的细胞壁降解酶为β-葡萄糖苷酶,且在侵染过程中病健交界处的活性最高,在寄主体外诱导β-葡萄糖苷酶最佳碳源为滤纸诱导物。3.链格孢菌侵染枣果过程中毒素对骏枣果皮的胁迫作用利用链格孢菌毒素提取液处理枣果皮组织,并测定其细胞膜透性,同时测定了丙二醛含量以及过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶的活性,研究了该毒素的致病机制。结果显示,链格孢菌产生的毒素,能抑制细胞组织中活性氧清除酶的活性,其中过氧化氢酶的活性在短时间内下降了67.06%,导致细胞中的活性氧高浓度积聚,扰乱了机体的正常代谢,造成细胞损伤,使其失去正常的生理功能。由于细胞膜的损坏,会造成电解质渗漏,电导率则呈上升趋势,相对电导率极差最大为33%。丙二醛含量呈上升趋势,最高可达36.6nmol/g,膜脂过氧化程度加深,因此丙二醛的含量同样可以作为细胞损伤程度的标志。毒素处理后,细胞损伤程度加深,最终会引起寄主死亡。研究结果表明链格孢菌的毒素对骏枣具有胁迫作用,反映了致病性和毒素的关系。4.链格孢菌侵染枣果过程中形态结构变化为了探究链格孢菌侵染枣果过程形态结构变化,利用绿色荧光蛋白基因(GFP)标记该菌株,通过分子转化体系研究病原菌侵染过程。将带有GFP标记的链格孢菌接种于枣果体内,6h时在枣果实表面可明显观察到孢子萌发;接种后12h,萌发形成的芽管逐渐伸长;24h时形成了稀疏的单根菌丝,侵入到表皮细胞内;接种后48h,在枣果实组织内部充斥着密集的菌丝体,并朝不同的方向生长。枣果被侵染后,黑色病斑逐渐扩大,病斑中心部分下陷,果实皱缩变干;经链格孢菌入侵的病枣组织细胞有破损,在细胞间隙和细胞中存在大量菌丝,组织细胞形状发生变化。从组织病理学的角度观察了GFP标记的链格孢菌侵染枣果后形态结构变化过程,为链格孢菌-寄主互作关系提供依据。
【学位单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.65
【部分图文】：

其范围为 1-2mm；图 2-1 f 为切开后症则形状的水渍状小病斑，有黑色霉状物产生。皮下组织变褐坏死，病组织易剥离。以上结果状不明显，采用菌块贴接法接种后有明显的发3 组链格孢菌菌株具有较强的致病性。表 2-2 不同病原菌的发病率Table 2-2 Incidence of different pathogens真菌种类Fungal species株数Number ofshares接种数Number ofvaccinations发病Inciderate（格孢菌 Alternaria 10 50 54霉菌 Penicillium 4 20 0刀菌 Fusarium 2 10 0菌 Aspergillus niger 5 25 0

注：a-b 产孢表型；c 分生孢子；e-f 菌落图 2-2 分生孢子和菌落Note: a.Sporulation phenotype;b.strain conidia；e-f.ColonyFigure 2-2 conidia and Colony2.3 讨论从新疆生产建设兵团第一师周边团场红枣种植区采集分离病原菌，对枣树果实病害枣黑斑病的病原菌进行鉴定，本试验采用常规组织分离法对病样进行分离[41]，并对病原物经行了单孢纯化，链格孢菌占总分离菌株总数 78%；通过致病性检测青霉菌、镰刀菌和黑曲霉菌等均不发病。对链格孢菌进行致病性检测，发现接种后的枣果有明显的发病现象。向征[42]从南疆枣树产区的枣园中采集了大量有枣黑斑病发病症状的果实，并从病样中分离菌株，经培养后观察，菌落正反面有同心螺纹与本试验所得结果相似。本试验中链格孢菌接种枣果后有明显发病症状，通过致病性检测，链格孢菌的发病率为 54%，

图 3-1 半乳糖醛酸标准曲线Fig.3-1 standard curve of galacturonic acid导物对细胞壁降解酶活性的影响，在 6 种碳源培养条件下，枣黑斑病菌均能产生多β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶和解酶，表明枣黑斑病菌可产生多种类型的细胞壁降基中，6 种细胞降解酶酶活性存在一定差异。在果的聚甲基半乳糖醛酸酶和多聚半乳糖醛酸酶活性分显高于其它 4 种酶，且显著高于其他培养基产生的醛酸酶活性；同样，在滤纸诱导培养基中，β-葡萄高于其他培养基产生β-葡萄糖苷酶；羧甲基纤维素 7.75 U/mg，与其他培养基产生羧甲基纤维素酶存
【参考文献】

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本文编号：2844791