小菜蛾几丁质合成酶基因（PxCHS1）功能研究

发布时间：2020-10-22 04:10

　　 小菜蛾(Plutella xylostella)是一种世界范围内危害严重的害虫,其主要为害十字花科植物。本研究主要对几丁质合成酶1基因PxCHS1进行了功能分析。通过用细菌表达的靶dsRNA(dsPxCHS1)饲喂小菜蛾幼虫来研究几丁质合成酶1的基因沉默效果。基因表达分析表明,几丁质合酶1及其两种变体在不同的组织及不同的生命阶段均有相似的表达模式,但表达量存在差异,表明在不用组织及不同发育阶段对几丁质合成酶的调控存在差异。使用RNAi对目标基因的4个不同区域进行干扰,结果表明,干扰靶基因的5’和3’端具有较好的效果,干扰5’端效果最好。生测结果表明,连续给小菜蛾饲喂dsRNA 4天后,幼虫的死亡率与对照相比增加了约50%。饲喂dsRNA导致蛹的表型异常且延长了蛹期。由于饲喂dsRNA,蛹的尾部附着在幼虫体上从而干扰了蛹的羽化。与对照相比,处理组的羽化率下降43.33%,而幼虫和成虫阶段没有形态学差异。qPCR结果表明,喂食特异性的几丁质合酶基因dsRNA导致相对基因表达水平低于对照,具体表现为在喂食后24小时,基因表达水平比对照减少53.5%,然而,在喂食48小时后,其相对表达水平却上升,表明摄入的RNAi的瞬时效应。通过对小菜蛾幼虫进行Illumina测序后发现了1348个新基因,并在COG(140)、GO(406)、KEGG(308)、KOG(488)、Pfam(573)、Swiss-Prot(402)、eggNOG(1003)和nr(1335)数据库中进行了注释。转录组数据表明,RNA降解和剪接体途径相关基因、Lsm蛋白在饲喂dsPxCHS1的幼虫中下调,表明减少了mRNA的降解。但要明确dsPxCHS1的对小菜蛾基因表达调控的影响,尚需进一步深入研究。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S433.4
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
Abbreviations
CHAPTER 1: RNAi for gene functional analysis and pest control, a Review
    1 Introduction
    2 Biology, Ecology and Management of Diamondback moth
        2.1 Diamondback moth: A Chinese perspective
        2.2 Basic biology
        2.3 General life cycle
        2.4 Current DBM management strategies
        2.5 Environmental friendly integrated pest approaches -Biological control of DBM
    3 Chitin synthases in Insects
        3.1 Regulation of insect chitin synthases
    4 RNA interference
        4.1 RNAi pathways and mechanism
        4.2 RNAi for insect pest management
        4.3 Factors affecting RNAi efficiency
    5 RNAi for gene functional analysis
CHAPTER 2: Gene cloning and Functioanl analysis of chitin synthase gene1
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 Insects
        2.2 Vectors
        2.3 Gene
        2.4 Enzymes and Kits
        2.5 Microbiological media
        2.6 Stock solutions
        2.7 Main reagents for plasmid extraction
        2.8 Gene cloning
        2.9 Polymerase Chain Reaction
        2.10 Gel Electrophoresis and Purification
        2.11 Ligation
        2.12 Preparation of competent cells for transformation
        2.13 Confirmation of transformed bacteria by PCR and Plasmid digestion
        2.14 ds RNA vector construction
        2.15 IPTG induction for ds RNA production
        2.16 RNA digest
        2.17 Bioassay of the transformed bacteria expressing ds RNA
        2.18 Gene expression analysis
        2.19 Statistics and Data analysis
    3 Results
        3.1 Gene cloning
        3.2 Gene expression analysis of Px CHS1
        3.3 ds RNA production confirmation in bacteria
        3.4 Effect of ds RNA feeding on DBM larvae mortality
        3.5 Effect on growth parameters
        3.6 Effect of ds RNA feeding time on gene expression
    4 Conclusion
CHAPTER 3: Differential gene expression analysis upon ds RNA feeding
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 ds RNA feeding and sample preparation for RNA- seq
        2.2 RNA isolation c DNA library construction and Illumina sequencing
        2.3 De Novo transcriptome assembly, annotation and differential expression analysis
    3 Results
        3.1 Sequencing and de novo assembly of the P. xylostella transcriptome and differential geneexpression analysis
        3.2 Functional annotation
        3.3 Gene ontology （GO） and clusters of orthologous groups （COG） classification
        3.4 Functional annotation of differentially expressed genes （DEGs）
    4 Conclusion
CHAPTER 4: General Discussion and Conclusion
    4.1 Discussion
    4.2 Conclusion
Reference
Acknowledgements
Author information

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本文编号：2851074