突触融合蛋白MdSYP121和乙烯负调控苹果对轮纹病菌抗性的研究
发布时间：2020-10-27 00:52
苹果轮纹病由致病真菌Botryosphaeria dothidea所引起,危害树体,造成果实的腐烂,降低苹果的产量和品质,严重制约苹果产业的可持续发展。目前,关于苹果轮纹病菌的致病机理尚不清楚,阻碍苹果抗病机制的研究。因此,深入解析轮纹病菌的致病机理,对于挖掘苹果抗病基因、揭示抗病机制以及培育苹果抗病新品种等都具有重要的理论研究意义和实际应用价值。在病原菌侵染的过程中,植物体内通常伴随有抗性物质的运输及激素水平的变化。膜泡运输及乙烯信号转导途径在植物免疫过程中发挥重要作用。膜泡运输是植物与外界环境之间进行信息交流和物质交换的重要方式,在受到外界环境刺激时,植物可以通过抗性物质的运输及细胞壁成分的补充来应对各种胁迫。而膜泡运输在苹果与轮纹病菌相互作用中的具体调节机制尚未可知。乙烯通常作为生物胁迫中真菌和细菌病原体的毒力因子及防御反应的信号分子来参与植物的免疫反应。苹果在受到轮纹病菌侵染时产生大量的乙烯,加重果实的发病,因此乙烯信号转导途径在病菌侵染时的作用也亟待发掘。本研究以苹果为试验材料,运用遗传学及分子生物学手段首先明确了苹果膜泡运输中的突触融合蛋白MdSYP121通过影响SA信号转导途径及氧化还原过程负调控苹果对轮纹病菌的抗性;其次发现苹果受到轮纹病菌侵染时产生大量的乙烯,导致果实的发病加重,而乙烯受体的超表达增强了植物对乙烯的敏感性,降低了苹果对轮纹病菌的抗性。主要研究结果如下:(1)MdSYP121负调控苹果对轮纹病菌的抗性。本研究通过对接种轮纹病菌后的苹果进行转录组测序分析发现,MdSYP121处于蛋白互作网络的中心位置,与多种抗病机制相关,可能在抵御轮纹病菌侵染中具有重要功能。进一步的试验发现,当接种轮纹病菌后,沉默MdSYP121的愈伤组织的病斑面积小于对照,而超表达MdSYP121的愈伤组织和拟南芥的病斑面积大于对照,说明MdSYP121负调控植物对轮纹病菌的抗性。通过qRT-PCR检测发现,沉默MdSYP121的愈伤组织中SA合成相关基因EDS1、PAL、PAD4及信号转导相关基因PR1、PR5、NPR1的表达水平高于对照,而超表达MdSYP121的转基因愈伤组织和拟南芥中抗性相关基因的表达水平低于对照,由此推测MdSYP121可能通过影响SA介导植物抗病信号通路影响苹果的抗病性。(2)通过对未接种轮纹病菌以及接种轮纹病菌后的野生型和沉默MdSYP121基因的愈伤组织进行转录组测序分析发现,MdSYP121主要通过调控氧化还原过程(GO:0055114)和氧化还原酶活性(GO:0016491)两个生物过程影响苹果对轮纹病菌的抗性。APX、CAT、POD和GST是与氧化还原反应密切相关的酶基因,通过qRT-PCR和酶活性检测结果发现,接种轮纹病菌后,上述基因的表达受到轮纹病菌的强烈诱导,同时相应氧化还原酶的活性也显著提高,这说明MdSYP121可能通过调控氧化还原过程影响植物对轮纹病菌的抗性。(3)MdSYP121通过形成复合体在植物体内发挥作用。亚细胞定位分析发现MdSYP121及MdSNAP33定位于细胞质膜。通过BiFC和pull down试验证明,MdSYP121可以与MdSNAP33互作,在质膜上形成二元-SNARE靶膜复合体介导细胞的分泌过程。通过SDS-resistance试验证明在苹果中MdSYP121通过形成SNARE复合体发挥作用。(4)在受到轮纹病菌侵染时苹果释放出大量乙烯,导致轮纹病的发病程度加重。接种轮纹病菌后,随着天数的增加,苹果中乙烯的释放量逐渐增多,病斑面积逐渐扩大。不同发育时期果实的乙烯释放量和病斑面积有所不同。接种轮纹病菌后,盛花期后60天果实乙烯释放量少,病斑面积小;盛花期后100天-160天果实乙烯释放量增多,病斑面积增大;盛花期后180天乙烯释放量减少,病斑面积也有所降低。qRT-PCR结果显示,轮纹病菌通过诱导乙烯合成相关基因的表达而促进乙烯的合成。MdACS5A和MdACS5B是由伤害胁迫引发的植物乙烯合成的关键基因。盛花期后140天和160天时,轮纹病菌通过诱导植物乙烯合成关键基因MdACS5A和MdACS5B的表达显著提高乙烯的合成。进一步的研究发现,与未接种轮纹病菌的果实相比,盛花期后60天果实接种轮纹病菌后乙烯释放量相对较少,MdPR2、MdPR4、MdPR5、MdPR8等抗性相关基因的表达量较高;而盛花期后140天和160天乙烯释放量显著增加,PR相关基因表达水平下降。因此,轮纹病菌可能通过促进苹果中乙烯的生物合成,抑制苹果抗性相关基因表达,降低苹果的抗病性。(5)超表达苹果乙烯受体增强植物对乙烯的敏感性。将苹果乙烯受体MdEIN4、MdETR1、MdETR2和MdERS1分别转化拟南芥植株,“三重反应”试验证明,当ACC存在时,抑制了拟南芥下胚轴的伸长,超表达MdEIN4的拟南芥植株下胚轴长度为对照拟南芥的0.67倍,而MdETR1、MdETR2和MdERS1的转基因拟南芥植株下胚轴长度与对照类似,说明MdEIN4在苹果乙烯信号转导途径中对乙烯更为敏感。(6)苹果乙烯受体负调控苹果对轮纹病菌的抗性。对超表达乙烯受体MdEIN4、MdETR1、MdETR2和MdERS1的转基因拟南芥叶片接种轮纹病菌后发现,超表达乙烯受体的转基因拟南芥叶片病斑面积和菌丝扩展程度高于对照和乙烯不敏感型突变体ein2,其中超表达Md EIN4的转基因拟南芥叶片病菌扩展面积及菌丝侵染程度最大。qRT-PCR结果显示,接种轮纹病菌后,超表达MdEIN4的拟南芥中PR基因的表达量最低。当用CoCl_2处理后,MdEIN4转基因拟南芥叶片病斑面积和病菌侵染程度显著降低,PR基因的表达水平升高,推测MdEIN4转基因拟南芥可能通过影响抗性相关基因的表达而降低苹果对轮纹病菌的抗性。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.611.1
【部分图文】：
突触融合蛋白 MdSYP121 和乙烯负调控苹果对轮纹病菌抗性的研究SynaPtobrivin，Betlp 及 BoslP 组成；第二类 SNAREs 蛋白不含跨修饰锚定于膜，如 SNAP25 含 2 个 SNAREs 基序，中间间隔一胱氨酸可被棕榈酰化，进而使 SNAP25 附着于质膜；第三类 SNARE 基序，如 VAMP7 及 Syntaxin 变异体，其羧基端有半胱氨氨酸的修饰将其锚定于质膜（Kwon et al., 2008）。 SNARE 蛋白的结构发现的 SNARE 蛋白有 30 多种，均为膜结合蛋白，所有蛋白都的 SNARE 基序，该基序可介导 SNAREs 各亚单位形成核心复合通常包括 1 个突触融合蛋白（Syntaxin，含有 Qa-SNARE 结蛋白（含有 Qb-和 Qc-SNARE 结构域）和 1 个 VAMPs 蛋白（Vesicrotein）（含有 R-SNARE 结构域）（图 1-1）。
进而激活ERFs、EBF2、PORA和PORB等下游基因表达，使乙烯信号向下游传递完成乙烯应答反应（Ju et al., 2012；Merchante et al., 2015；An et al., 2010）。图1-2 拟南芥乙烯信号转导途径示意图（Guo and Ecker, 2004）Fig. 1-2 Schematic diagram of the ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis（Guo and Ecker, 2004）1.4.1 植物乙烯信号转导途径乙烯信号转导途径是由乙烯受体对乙烯的感知所开始的。Chang 等从拟南芥中鉴定了第一个乙烯受体 ETR1，随后又分离得到了 ETR2，EIN4，ERS1 和 ERS2 四种乙烯受体（Chang et al., 1993；Hua et al., 1995；Hua et al., 1998；Sakai et al., 1998）。乙烯受体为双组分受体，在含有乙烯结合结构域的 N-末端区域具有三个跨膜 α-螺旋，接着是 GAF 结构域和类似原核组氨酸激酶的结构域（HK）（Schaller and Bleecker,1995）。GAF 结构域涉及受体间的非共价蛋白质-蛋白质相互作用，可能有助于调节信号输出（Gao et al., 2008）。C 末端为信号输出结构域（Gao and Stock, 2009）。在拟南芥中，乙烯受体根据其结构特点可以分为两类：I 类包括 ETR1 和 ERS1；II 类包括 ETR2
山东农业大学博士学位论文3 结果与分析3.1 苹果 MdSYP121 基因的分离及生物学功能分析为了研究苹果抵御轮纹病菌侵染的分子机制，我们对接种轮纹病菌的‘富士’苹果果实进行了转录组测序分析。通过分析结果发现，MDP0000709455处于植物抗病网络的重要位置（图3-1），并且MDP0000709455的同源基因在大麦和拟南芥抵御白粉病菌侵染过程中起到重要的作用（Collins et al., 2003），因此我们推测该基因在苹果抵御轮纹病菌侵染中具有重要作用。
【参考文献】
本文编号：2857770
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.611.1
【部分图文】：
突触融合蛋白 MdSYP121 和乙烯负调控苹果对轮纹病菌抗性的研究SynaPtobrivin，Betlp 及 BoslP 组成；第二类 SNAREs 蛋白不含跨修饰锚定于膜，如 SNAP25 含 2 个 SNAREs 基序，中间间隔一胱氨酸可被棕榈酰化，进而使 SNAP25 附着于质膜；第三类 SNARE 基序，如 VAMP7 及 Syntaxin 变异体，其羧基端有半胱氨氨酸的修饰将其锚定于质膜（Kwon et al., 2008）。 SNARE 蛋白的结构发现的 SNARE 蛋白有 30 多种，均为膜结合蛋白，所有蛋白都的 SNARE 基序，该基序可介导 SNAREs 各亚单位形成核心复合通常包括 1 个突触融合蛋白（Syntaxin，含有 Qa-SNARE 结蛋白（含有 Qb-和 Qc-SNARE 结构域）和 1 个 VAMPs 蛋白（Vesicrotein）（含有 R-SNARE 结构域）（图 1-1）。
进而激活ERFs、EBF2、PORA和PORB等下游基因表达，使乙烯信号向下游传递完成乙烯应答反应（Ju et al., 2012；Merchante et al., 2015；An et al., 2010）。图1-2 拟南芥乙烯信号转导途径示意图（Guo and Ecker, 2004）Fig. 1-2 Schematic diagram of the ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis（Guo and Ecker, 2004）1.4.1 植物乙烯信号转导途径乙烯信号转导途径是由乙烯受体对乙烯的感知所开始的。Chang 等从拟南芥中鉴定了第一个乙烯受体 ETR1，随后又分离得到了 ETR2，EIN4，ERS1 和 ERS2 四种乙烯受体（Chang et al., 1993；Hua et al., 1995；Hua et al., 1998；Sakai et al., 1998）。乙烯受体为双组分受体，在含有乙烯结合结构域的 N-末端区域具有三个跨膜 α-螺旋，接着是 GAF 结构域和类似原核组氨酸激酶的结构域（HK）（Schaller and Bleecker,1995）。GAF 结构域涉及受体间的非共价蛋白质-蛋白质相互作用，可能有助于调节信号输出（Gao et al., 2008）。C 末端为信号输出结构域（Gao and Stock, 2009）。在拟南芥中，乙烯受体根据其结构特点可以分为两类：I 类包括 ETR1 和 ERS1；II 类包括 ETR2
山东农业大学博士学位论文3 结果与分析3.1 苹果 MdSYP121 基因的分离及生物学功能分析为了研究苹果抵御轮纹病菌侵染的分子机制，我们对接种轮纹病菌的‘富士’苹果果实进行了转录组测序分析。通过分析结果发现，MDP0000709455处于植物抗病网络的重要位置（图3-1），并且MDP0000709455的同源基因在大麦和拟南芥抵御白粉病菌侵染过程中起到重要的作用（Collins et al., 2003），因此我们推测该基因在苹果抵御轮纹病菌侵染中具有重要作用。
【参考文献】
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本文编号：2857770
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