番茄褪绿病毒RT-PCR检测方法的优化及环保酵素对番茄褪绿病毒病抗性影响的研究

发布时间:2020-10-28 06:16
   番茄褪绿病毒病(Tomato chlorosis virus,ToCV)是最近新发生的为害番茄生产最严重的病害之一,与其有关的研究很少,特别是关于褪绿病毒基因组结构、被侵染植株褪绿病毒分子检测、以及对防控褪绿病毒病暴发的有效措施等方面都还不清楚,迫切需要对ToCV病害进行精准鉴定和及时防治。本研究通过对选自文献报道和重新设计的6对ToCV的RT-PCR检测引物进行比较分析,筛选出灵敏度、稳定性较高的引物组合,并对影响RT-PCR反应的条件进行优化,确定最优的反应条件。应用于咸阳兴平市、咸阳泾阳县、咸阳三原县、渭南富平县、宝鸡太公镇、咸阳武功镇、咸阳五泉镇、咸阳杨陵区、西安阎良区、西安高陵区、铜川野狐坡村、铜川水峪村等地温室大棚内的番茄植株ToCV的检测,对ToCV与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)复合侵染情况进行检测,通过对ToCV基因组CP(Coat protein)和HSP70(Heat-shock protein 70 family)核苷酸和氨基酸序列进行测序,与Genbank数据库内已登录的ToCV核苷酸和氨基酸序列进行一致性比对和系统发育分析,初步探究了陕西关中地区番茄种植产区ToCV类型及其与TYLCV复合侵染的发生及分布情况。此外,利用实时荧光定量PCR对ToCV的侵染进行检测,精确判断感病植株不同部位的病毒含量,为后续研究番茄褪绿病毒病的发病趋势奠定研究基础。另外,初步探究了环保酵素对番茄植株的生长和抗病性的影响,试图探索一种预防ToCV发生的新栽培措施。主要结果如下:(1)引物To-CP-F/R-1和SDLC-HSP-F/R的灵敏度和特异性最好。引物To-CP-F/R-1扩增最适反应条件为,退火温度在48.0~64.0℃之间,引物浓度区间为4~10μM。引物SDLC-HSP-F/R扩增最适退火温度在40.9~64.3℃范围内,最适引物浓度为4~10μM。(2)陕西关中地区番茄产区ToCV检出率为40.94%。对获得的分离物核苷酸序列与已登录的分离物核苷酸序列进行比对,除与台湾和广东分离物的核苷酸序列一致性较低外,与其他地区分离物核苷酸序列一致性在96%以上。并对已获得分离物和Genbank中已登录分离物的核苷酸和氨基酸序列构建系统进化树,结果表明本研究所得分离物均聚类在同一分组上,除与台湾及广东的距离较远外,与国内分离物均较近。可推断国内ToCV具有共同的传播来源。与美国的亲缘关系最近,西班牙的亲缘关系最远。(3)进行ToCV检测的同时进行TYLCV的检测,检出率为69.79%,该病检出率高于前者。表明陕西关中地区番茄产区温室大棚内番茄上存在两种病害复合侵染的情况。(4)本研究在稳定RT-PCR检测方法的同时,运用实时荧光定量PCR的检测方法,进行快速鉴定,对RT-PCR检测结果进行补充说明。通过对植株不同部位的叶片进行检测,发现同一植株不同部位病毒相对含量存在差异。(5)一定稀释比例的环保酵素不仅对番茄幼苗的生长起到了促进作用,而且也提高了番茄幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和过氧化物酶(POD)活性,说明适当稀释比例的环保酵素可增强植株的抗逆性。但从发病调查结果和检测结果来看,环保酵素对增强番茄植株对ToCV抗病性的作用不显著。
【学位单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2019
【中图分类】:S436.412.11
【部分图文】:

示意图,基因组结构,示意图,蛋白质


图 1-1 ToCV RNA1/2 基因组结构示意图Figure. 1-1 Schematic representation of the genomic structure of the RNA 1/2 of ToCVRNA 2 长8244 nt,编码9个开放阅读框,蛋白功能主要包括病毒的组装、运动以及传播。ORF 1,即p4,编码一个分子量为3.9 KDa,起跨膜蛋白功能并且富含疏水残基的小蛋白质。ORF 2,即Hsp70h,编码59 KDa的蛋白质,该蛋白高度保守,与病毒的组装和运动有关。ORF 3,即p8,编码7.6 KDa的蛋白质,该区域发现具有与毛形病毒属的其他成员相似大小的基因,相同的基因组位置和序列以及中心保守的氨基酸序列。ORF 4,即p59,编码59.4 KDa的蛋白质,这些蛋白质是病毒在细胞与细胞之间运动和组装必不可少的。ORF 5,即p9,编码9.3 kDa蛋白质,具有与毛形病毒属其他成员等同的蛋白质编码位置,且具有35-45%相似的氨基酸。ORF 6,即CP,编码28.9 kDa的高度保守蛋白质。ORF 7,即CPm,编码76.0 kDa蛋白质,具有与病毒传播有关的功能。ORF 8,即p27,编码27.0 kDa的蛋白质,具有与同属其他成员相似大小和基因组位置的蛋白质,但它们之间的氨基酸相似性相对较低。ORF 9,即p7,编码一个小的7.5kDa蛋白质,具有富含疏水残基的跨膜结构域,但没有与任何已知蛋白质具有相似性,并且在其他毛形病毒属的成员基因组中也没有等同物(G. Lozano et al. 2006)。

引物,浓度


图 3-3 To-CP-F/R-1 和 SDLC-HSP-F/R 最适引物浓度筛选(Marker:Trans5K Plus DNAmarker;A:表示引物 To-CP-F/R-1;B:表示引物 SDLC-HSP-F/R;1~10:依次表示引物浓度分别为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μM。)Figure 3-3 Screening primer concentrations on PCR detection of To-CP-F/R-1 and SDLC-HSP-F/R(Marker: Trans5K Plus DNAmarker; A: indicates primer To-CP-F/R-1; B: indicates primerSDLC-HSP-F/R; 1~10: Primer concentrations is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM , respectively .)

退火温度,引物,最适范围


第三章 结果与分析μM 时,引物 To-CP-F/R-1 的退火温度在 48.0~64.0℃范围内扩增效果最佳(图 3-4),引物 SDLC-HSP-F/R 的退火温度最适范围是 40.9~64.3℃。高于、低于这个温度范围均影响扩增效率。图 3-3 To-CP-F/R-1 和 SDLC-HSP-F/R 最适引物浓度筛选(Marker:Trans5K Plus DNAmarker;A:表示引物 To-CP-F/R-1;B:表示引物 SDLC-HSP-F/R;1~10:依次表示引物浓度分别为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μM。)Figure 3-3 Screening primer concentrations on PCR detection of To-CP-F/R-1 and SDLC-HSP-F/R(Marker: Trans5K Plus DNAmarker; A: indicates primer To-CP-F/R-1; B: indicates primerSDLC-HSP-F/R; 1~10: Primer concentrations is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM , respectively .)
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本文编号:2859709

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