禾谷镰刀菌中FgKAR9及其互作蛋白的鉴定与功能分析
发布时间：2020-10-28 14:23
禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的优势种之一,该病菌不仅严重影响小麦产量和品质,其在侵染过程中还会产生赤霉菌毒素,对人畜健康造成较大威胁。微管是细胞骨架的重要组分,在真菌的极性生长、物质运输、有丝分裂和维持细胞形态等众多生物学过程中起重要作用。同时,微管作为苯并咪唑类杀菌剂的作用靶标在病害防治中具有重要意义。微管功能依赖于与其结合的微管相关蛋白,目前对微管和微管相关蛋白的研究已发展为细胞生物学的一个重要分支。在禾谷镰刀菌中,存在两个β-微管蛋白FgTub1和FgTub2。已知两个β-微管蛋白之间存在明显的功能分化,FgTUB1为有性生殖所必需,FgTUB2与病菌抗药性和菌丝生长密切相关,将FgTUB2敲除后会导致营养生长缓慢,菌落变小。本研究在对Fgtub2突变体培养过程中发现,其易自发突变形成生长恢复的角变子。对角变子进行收集共计38个,按照生长速率快慢分为3种类型,选取每类3-4个代表菌株,共计14个进行了全基因组重测序,分析筛选可能与FgTUB2相关的基因。结果发现,角变子b-9-1s和b-10-6分别在FgKAR9基因上发生了不同位置的终止突变。为验证是否因FgKAR9基因突变引起的角变现象,我们使用Split-PCR的方法在Fgtub2突变体中敲除FgKAR9和在Fgkar9突变体中敲除FgTUB2获得了Fgtub2kar9和Fgkar9tub2双敲突变体;对角变子b-9-1s、b-10-6和Fgtub2kar9、Fgkar9tub2的表型进行观察,发现b-9-1s、b-10-6的生长速率、致病力较Fgtub2有部分恢复,产孢量和有性生殖正常;突变体Fgtub2kar9、Fgkar9tub2与其角变子在生长速率、致病力等各方面表型均一致,说明FgKAR9发生终止突变能部分弥补FgTUB2基因缺失带来的表型缺陷。通过基因敲除、PCR检测和southern验证,得到2个Fgkar9缺失突变体菌株。对其进行表型观察发现其营养生长和有性生殖均正常。通过将FgKAR9融合到带有RP27强启动子的pFL2质粒中得到融合表达载体并转入PH-1获得FgKAR9过表达菌株,对其进行表型观察也未发现异常。对FgKAR9进行亚细胞定位观察发现,FgKar9蛋白在细胞中沿着FgTub2微管蛋白丝进行高速运动,表现为不连续的线状,并且在芽管的顶端有少量富集。通过双分子荧光互补实验证明FgTub2与FgKar9互作,表明FgKAR9在微管功能的调控中发挥着重要作用。通过酵母双杂实验证明FgKar9与FgBim1互作,推测FgKAR9可能与FgBIM1共同调节微管功能。综上所述,本研究从Fgtub2突变体产生的角变子出发,得出微管相关蛋白FgKAR9基因在微管功能的调控中发挥着重要作用,通过对FgKAR9及其互作蛋白的鉴定和功能分析,初步揭示了禾谷镰刀菌中FgKAR9引起Fgtub2突变体发生角变的机理。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.121.45
【部分图文】：
子（无性孢子）和子囊孢子（有性孢子），分生孢子面会产生颜色紫黑色的卵圆状子囊壳，其顶端有呈瘤放，子囊内含 8 个子囊孢子。子囊孢子无色，两端钝, 2004; 武爱波等 2005)。为害多种禾本科粮食作物，在田间拥有众多寄主。在包括小麦玉米、水稻、棉花等重要作物以及狗尾草、云平 2006）。小麦的整个生育期均可能受到禾谷镰刀腐和穗枯等症状，病害发生严重时可使小麦田颗粒于带菌的种子和病残体，适宜条件下，这些病残体快子囊孢子，孢子借助风雨、昆虫等媒介从而传播到禾湿的条件下，受到该病菌侵染的小麦穗部会出现大量雨和其它媒介转移到邻近小麦上引起再侵染，如此循发。到发病后期天气潮湿的情况下，发病小麦穗部的，在条件适宜时子囊孢子则可成为下一个侵染循环的初
YEPD 培养基的破碎杯中进行破碎，2-3 次，每次 10-15 秒。后 ℃摇培 24 h，再重复破碎一次，25 ℃摇培 12-16 h，开始收集菌收集到菌丝压干水分，置于液氮中预冷，送公司做重测序分析。果2 突变体在 V8 培养基上发生角变gtub2 突变体进行培养的过程中，发现其在 V8 培养基上出现了菌角变现象（图 2-1）。WT Fgtub2
图 2-2 禾谷镰刀菌 FgKAR9 与其它真菌同源基因的多序列比对以及 b-9-1s、b-10-6发生终止突变的位置Figure 2-2 Multiple sequence alignment of F. graminearum FgKAR9 with other fungalhomologous genes and the termination mutations of b-9-1s and b-10-69
【参考文献】
本文编号：2860207
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.121.45
【部分图文】：
子（无性孢子）和子囊孢子（有性孢子），分生孢子面会产生颜色紫黑色的卵圆状子囊壳，其顶端有呈瘤放，子囊内含 8 个子囊孢子。子囊孢子无色，两端钝, 2004; 武爱波等 2005)。为害多种禾本科粮食作物，在田间拥有众多寄主。在包括小麦玉米、水稻、棉花等重要作物以及狗尾草、云平 2006）。小麦的整个生育期均可能受到禾谷镰刀腐和穗枯等症状，病害发生严重时可使小麦田颗粒于带菌的种子和病残体，适宜条件下，这些病残体快子囊孢子，孢子借助风雨、昆虫等媒介从而传播到禾湿的条件下，受到该病菌侵染的小麦穗部会出现大量雨和其它媒介转移到邻近小麦上引起再侵染，如此循发。到发病后期天气潮湿的情况下，发病小麦穗部的，在条件适宜时子囊孢子则可成为下一个侵染循环的初
YEPD 培养基的破碎杯中进行破碎，2-3 次，每次 10-15 秒。后 ℃摇培 24 h，再重复破碎一次，25 ℃摇培 12-16 h，开始收集菌收集到菌丝压干水分，置于液氮中预冷，送公司做重测序分析。果2 突变体在 V8 培养基上发生角变gtub2 突变体进行培养的过程中，发现其在 V8 培养基上出现了菌角变现象（图 2-1）。WT Fgtub2
图 2-2 禾谷镰刀菌 FgKAR9 与其它真菌同源基因的多序列比对以及 b-9-1s、b-10-6发生终止突变的位置Figure 2-2 Multiple sequence alignment of F. graminearum FgKAR9 with other fungalhomologous genes and the termination mutations of b-9-1s and b-10-69
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1 武爱波;禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）致病力鉴定、毒素检测及其分子生物学研究[D];华中农业大学;2005年
本文编号：2860207
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